唐红 陈恩强   四川大学华西医院

　　HBV在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者体内的持续复制可以导致不同程度的肝脏炎症，同时感染HBV的肝细胞与宿主免疫反应之间复杂的相互作用极大地影响着慢性肝炎的疾病进展。研究已经证实，及时有效地抗病毒治疗不仅可以使疾病缓解，而且可以延缓或阻止肝硬化进程，并能够减少或防止出现肝功能衰竭和（或）肝细胞肝癌等严重后果。当前临床应用的抗HBV药物主要包括干扰素（IFN-α）和核苷（酸）类似物两大类，但两类药物的共同不足是HBsAg清除率低，且大多数患者即使经过长期抗病毒治疗也难以彻底清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），这就导致病毒持续存在和停药后复发率较高。随着研究和临床治疗的不断进步，人们对HBV本身及其与宿主相互作用的认识也不断加深。目前多数学者认为，将来CHB的治疗需要考虑多靶位药物的联合治疗，药物作用靶位将针对HBV生命周期中的各个关键环节以及对机体抗HBV免疫应答能力的提高，其中靶向影响HBV复制与清除的关键宿主因子是当前的研究热点和具有应用前景的发展方向。

　　一、影响HBV复制生命周期中各关键环节的宿主因子HBV的生活周期涉及病毒进入细胞、HBV DNA进入胞核形成cccDNA、HBV RNA转录、HBV DNA复制、HBV病毒的包装和成熟及排泌等过程。HBV进入肝细胞后脱去核壳，HBV基因组DNA进入细胞核，以负链DNA为模板延长正链并修补，封闭正链中的裂隙，形成共价闭合环状DNA（cccDNA）。然后，cccDNA作为模板，在宿主RNA聚合酶的作用下转录生成几种不同长短的RNA。其中，除编码合成HBcAg、HBeAg和DNA多聚酶外，3.5 kb前基因组RNA还具有一个重要功能，即作为病毒逆转录复制的模板。在病毒复制过程中，HBV DNA多聚酶结合于3.5 kb前基因组mRNA 5’端ε茎-环结构，形成RNA/多聚酶复合物，并被HBcAg多肽二聚体包裹成未成熟的核壳体。在核壳体内的HBV DNA多聚酶催化下，以3.5 kb前基因组RNA为模板，逆转录合成负链HBV DNA，然后再以负链DNA为模板合成正链HBV DNA。最终形成子代的不完全双链环状DNA。因此，HBV基因组（尤其是3.5 kb前基因组）RNA转录的调控是病毒生活周期中至关重要的环节。

　　1.针对病毒进入细胞环节：病毒吸附、穿入宿主细胞是一个复杂的过程，多年来一直是病毒性疾病预防和治疗选择的靶点。阻止HBV入胞不仅是预防HBV感染和防止感染后病毒肝内扩散的一种重要手段，也是CHB抗病毒治疗的一个重要靶点。既往有研究显示，HBV可通过包膜蛋白抗原环硫酸乙酰肝素结合位点与肝细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）静电结合，且HBV与HSPG的亲和力随着聚集病毒颗粒的增加而增强，进而介导病毒入胞。进一步的研究发现，人工合成抗脂多糖肽端（synthetic anti-lipopolysaccharide peptides，SALP）可通过结合HSPG来抑制HBV进入宿主细胞。人乳铁蛋白衍生肽段1～23包含GRRRR阳离子簇，可中和病毒包膜表面带负电的氨基酸残基而阻止HBV的黏附和侵入。近年来，我国科学家发现，人肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）可与HBV包膜蛋白的关键受体结合域发生特异性相互作用，在介导HBV入胞过程中发挥重要作用，而环孢素A及其类似物可通过作用于肝细胞膜上的NTCP进而抑制HBV进入肝细胞，提示NTCP有可能成为乙型肝炎及相关肝病治疗的又一新靶点。已有学者提出，HBV入胞抑制剂与现有治疗药物的联合方案有可能是将来预防和治疗HBV感染的主要策略。

　　2.针对cccDNA形成的环节： HBV cccDNA能以游离基因形式独立稳定储存于肝细胞核内，在HBV感染慢性化和肝炎复发中具有重要作用。有研究显示，宿主抗病毒机制中活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidinedeaminase，AID）能将HBV cccDNA上胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，从而使病毒复制力降低，达到抑制复制甚至清除病毒的目的，提示AID是潜在的具有抑制cccDNA形成功能的重要宿主因子。尽管宿主体内尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase, UNG）可通过切除突变DNA中的尿嘧啶来恢复或部分恢复病毒复制能力，但当UNG被抑制后，HBV cccDNA上大量胞嘧啶仍可被脱氨基生成尿嘧啶，导致病毒P区开放阅读框产生大量的终止密码子，从而使AID介导的抗病毒活性被显著增强，并明显降低胞内HBV转录复制的产物以及胞外病毒颗粒分泌水平。最近研究发现，ApoB mRNA编辑酶在细胞核内催化多肽样蛋白3A（apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide-like protein 3A，APOBEC3A）活化，APOBEC3A可直接作用于病毒DNA，在HBV核心蛋白的交互作用下，诱导胞嘧啶脱氨以及脱嘌呤或脱嘧啶位点形成，最终降解cccDNA，且APOBEC3A对宿主基因组DNA无影响。这种APOBEC3A介导的cccDNA降解的方式具有很好的特异性，且不影响肝细胞核，有可能为清除HBV以及治疗CHB提供安全的治疗新选择。

　　3．针对HBV基因转录与复制环节：HBV属嗜肝DNA病毒，其基因组全长3.2 kb，具有四个启动子（Cp、PS1p、Sp和Xp）和两个增强子（EnhⅡ和EnhⅠ），分别调控3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb HBV mRNA的转录，并进而编码合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBxAg，且3.5 kb前基因组RNA（pregenomic RNA）也是病毒逆转录复制的模板。HBV基因组的转录是病毒复制过程中最关键的步骤并受到多种泛嗜和肝富集转录因子的调控。肝富集转录因子是一类具基因转录调控作用的蛋白质分子，主要存在于宿主肝脏。我们应用HBV非肝源细胞复制体系，对各种肝富集转录因子（包括HNF-1、HNF-3β、HNF-4α、RXR-α/PPAR-α、C/EBP和HNF-6等）在HBV基因转录及病毒复制水平的作用进行了深入研究。我们发现，HNF-4α和RXR-α/PPAR-α通过与HBV基因组C启动子结合而促使病毒前基因组RNA的合成，并能支持HBV在非肝源细胞中的复制，是HBV前基因组RNA合成和病毒复制的决定因素。HBV感染和致病的一个显著特点是嗜肝性，虽然肝细胞膜上存在特异性病毒受体是HBV嗜肝性的可能原因之一，但该理论难于解释为何在HBV转基因鼠中，HBV DNA存在于全身各组织器官，而HBV转录和表达产物却主要局限于肝脏。因此在肝细胞内应该还存在另一水平的调节机制。我们的研究结果表明，肝细胞内存在的特异性转录调控因子使HBV的基因转录复制具有肝特异性，而肝富集转录因子HNF-4α和RXR-α/PPAR-α是限制HBV在肝细胞内复制的独特分子开关，其在转录水平对HBV复制的调控是HBV嗜肝性的决定因素之一。

　　我们通过对包括慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝癌及慢性重症乙型肝炎等不同病情患者的HBV基因组进行研究发现，HBV C启动子远端核激素受体结合位点发生A1762T和G1764A核苷酸替代（称“TA”变异）的变异株，是临床最常见的前C区变异之一，且发生HBV前C区“TA”变异株的患者病情进展更快、更严重。为了解该病毒变异株的产生机制，我们分别利用肝源和非肝源细胞模型，观察了HBV野生株和该“TA”变异株病毒复制的差异，结果发现TA变异阻断肝富集转录因子RXR-α/PPAR-α对HBV C启动子的结合，但对HNF-4α与HBV C启动子的结合却无明显影响。与此相对应，RXR-α/PPAR-α能支持高水平的野生株复制；而HNF-4α则支持高水平的变异株复制。该研究结果提示肝富集转录因子水平的改变（例如HNF-4α水平升高或RXR-α/PPAR-α活性降低）可能会选择变异株的产生，且HNF-4α有可能通过增强“TA”变异株的转录复制水平，进而参与乙型肝炎病情的进展。此外，我们对CHB患者肝组织内肝富集转录因子水平与HBV复制水平间的相互关系进行了研究。结果发现，HBV慢性感染者肝组织中HBV DNA和病毒蛋白的表达水平与HNF-4α表达水平均呈正相关，与HNF-3β的表达水平呈负相关，提示肝富集转录因子对乙型肝炎患者肝组织内HBV复制具有重要调控作用。通过对不同病情HBV感染者的肝组织标本中HNF-4α和HNF-3β等肝富集转录因子的表达情况进行分析后发现，HNF-4α在重症乙型肝炎患者肝组织中的表达最高，提示HNF-4α在重症乙型肝炎发生中起重要作用，HNF-4α高水平与重症乙型肝炎的发生存在一定的相关性。上述结果提示，肝富集转录因子是调控慢性乙型肝炎患者体内HBV复制和疾病进展的重要宿主因子，体内肝富集转录因子水平可作为评估和预测乙型肝炎患者病情轻重和临床转归的新指标；同时通过调节肝富集转录因子表达水平有可能起到抑制HBV复制的作用，为开发新型抗病毒制剂提供了新的作用靶点。

　　近年亦有报道称，热休克蛋白70（Hsc70）和人锌指蛋白（hZAP）等宿主蛋白亦可影响HBV复制，如Hsc70蛋白表达下调或hZAP表达水平上调均可导致HBV复制水平的降低。

　　4.针对前基因组包裹和核衣壳装配环节:有关宿主因子在HBV包装、成熟和排泌中的研究也取得了一定的进展，如宿主Hsc90表达被抑制后可减少HBV pgRNA包装进入核衣壳中。有报道称芳基丙烯酰胺衍生物AT-130（一种非核苷HBV抑制剂）可阻止前基因组RNA装配成病毒颗粒及核衣壳的成熟，有效抑制HBV野生或耐药突变株的复制。杂芳基二氢化合物Bay 41-4109（另一类非核苷HBV抑制剂）能够通过干扰病毒衣壳蛋白的组装和促进核衣壳蛋白的解聚，从而发挥强效的抗HBV作用。近年研究发现，针对该靶位的化合物GLS4具有更强的抑制HBV DNA复制活性。

　　5.针对病毒组装与释放：有研究发现，N-丁基脱氧野艽霉素可通过抑制包膜蛋白糖基化修饰过程中的葡萄糖苷酶，可导致HBV包膜蛋白的错误折叠，进而抑制HBV颗粒的组装和释放。此外，阳离子细胞穿透肽亦可以造成包膜蛋白成簇聚集，影响核心颗粒的包被，从而阻止病毒的释放。

　　二、影响机体抗HBV免疫应答的宿主因子

　　HBV感染的肝细胞以及宿主免疫应答间的相互作用决定了疾病的进展和预后，其中宿主的免疫应答对HBV的清除有着重要作用，而CHB患者体内的这些免疫应答却存在着缺陷，使得机体不能清除病毒，并可导致病毒反复复制，病情迁延。

　　已有证据显示，宿主特异性T细胞免疫应答是清除HBV的最重要因素，如HBV急性感染转向慢性感染的患者缺乏早期的HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，并且CHB患者循环中的特异性T细胞功能也是衰竭的，无法清除病毒。具有强大抗原提呈作用的树突状细胞（DC）在CHB患者体内数量和功能均存在缺陷，髓系DC（mDC）和浆细胞样DC（pDC）表面的共刺激分子CD80、CD86及MHC（主要组织相容性复合体）-Ⅱ类分子的水平也明显降低，辅助性T细胞反应的能力降低，因而不能协助CTL有效地清除体内HBV。除了正向免疫应答在CHB患者体内发生功能缺陷，负向免疫调节因素反而增强，抑制了有效的免疫应答，如CHB患者体内不仅调节性T淋巴细胞（Treg）的数量增加，而且抑制性的共刺激分子PD-1及其配体PD-L1表达也明显升高，持续增强的负性调节信号严重损伤了病毒特异性CTL抗病毒功能，使得HBV在体内持续复制。

　　IFN-α是一种由宿主细胞合成和分泌并具有多种功能的活性蛋白质，目前已被批准用于临床CHB的抗病毒治疗。近年的研究报道显示，在IFN-α的诱导下，宿主可分泌出“外体”。“外体”富含多种抗病毒成分，能够抵抗或清除HBV感染。研究证实，“外体”是一种微囊结构，其大小为30～100纳米，由肝窦内皮细胞和巨噬细胞主动分泌生成，它在细胞间的通讯过程中发挥重要作用，参与多种生理、病理过程。宿主Toll样受体-7（TLR-7）被激动后，亦可增加IFN-α及趋化因子表达、促进IFN活化诱导基因表达和增强自然杀伤细胞对HBV感染细胞的清除能力，进而显著降低血清HBV DNA和抗原水平；而IL-12亦可通过提供CD8+T淋巴细胞活化所需的第三信号而修复CHB患者缺陷的T淋巴细胞，增强其细胞毒性作用及分泌抗病毒相关细胞因子能力，提示宿主TLR-7和IL-12的活化可作为治疗慢性乙型肝炎新的策略。此外，IL-7和IL-21等宿主因子在小鼠模型上显示出具有抗HBV活性。因此，在抗病毒治疗解除CHB患者免疫抑制的基础上，通过免疫调节治疗充分恢复患者抗病毒免疫应答，将有助于最终达到持久清除病毒、恢复机体免疫保护的目的。

　　总之，HBV基因转录和病毒复制受多个层面、多种因素的调控和影响，近年的研究虽然取得了较大进展，但许多环节尚未完全明了，值得进一步研究。对影响HBV转录复制的宿主因子及其调控机制的深入研究，将有可能为抗HBV药物的研发提供新的作用靶点。以影响HBV复制与清除的宿主因素为切入点，开发针对HBV生命周期中的各个关键环节和提高机体抗HBV免疫应答能力的宿主靶向新药物，同时开展多靶位药物的联合治疗，将有可能使更多的患者实现彻底清除体内HBV的愿望。