黄爱龙 重庆医科大学病毒性肝炎研究所

　　HBsAg清除可以作为慢性乙型肝炎治疗临床治愈的主要指标

 

　　乙肝表面抗原（HBsAg）由三种蛋白组成，是构成病毒颗粒（或球形、管型颗粒）的外膜蛋白。目前可以肯定的是，这些颗粒具有抑制人体免疫功能的作用。由于HBsAg在血清当中存在量较高，检测较方便，与肝内HBV的复制水平有较好的一致性，并且与HBV DNA病毒载量的下降、肝功的复常以及病原学的血清学转换等其他指标相比较，HBsAg的清除与药物疗效和疾病预后的联系更加明确，因此HBsAg的清除是目前慢性乙型肝炎临床治愈的主要指标。

 

　　清除HBsAg的直接策略和间接策略

 

　　现有干扰素和核苷（酸）类似物等药物清除HBsAg的作用非常有限，据报道最高仅10%左右，因此亟需开发一些新的策略来清除HBsAg。理论上，干扰HBV生活周期的任何一个环节都可能影响HBsAg的表达，具体可分为直接策略和间接策略。

 

　　直接策略包括：（1）在转录水平沉默cccDNA，因为cccDNA既是HBV建立感染状态的标志性事件，同时也是启动/指导病毒复制的关键分子，所以沉默cccDNA的表达可以影响HBsAg的表达，目前主要通过表观遗传学的方法来实现。（2）在转录后水平通过RNA干扰降解产生HBsAg的mRNA，这在国际上也有很多相关的临床和实验室研究。（3）通过阻断细胞内内膜递送系统的一些关键通路或分子，阻止HBV感染颗粒和亚病毒颗粒向胞外分泌，也可以达到降低血清中HBsAg滴度的作用。（4）通过针对HBsAg的抗体中和循环中的病毒颗粒，同样可以起到降低HBsAg的作用。

 

　　间接策略实际上是通过宏观干预HBV的复制周期，来达到微观降低HBsAg滴度的作用，具体可从获得性免疫、宿主与病毒相互作用以及调控HBV复制本身三个方面来理解：（1）在获得性免疫方面，更多关注的是细胞与细胞间的相互作用。这方面采用的相关策略主要是靶向卡控点分子（check-point）来达到逆转HBV免疫耐受的作用，这些卡控点分子包括CTLA-4、PD-1、Tim3等。机体对HBV处于一种免疫耐受的状态正是由于表达了这些抑制免疫应答作用的卡控点分子。如果能够降低这些卡控点分子的表达水平，就可能重新激活免疫应答，从而清除HBV。相关策略如CAR-T治疗最早用于肿瘤治疗，现在也已经开始用于艾滋病等一些病毒性疾病的治疗。虽然CAR-T治疗还没有引入乙肝领域，但相信在不久的将来一定会用于HBV的清除。（2）在宿主与HBV相互作用方面，主要包括两方面的含义：一方面是HBV感染状态的建立依赖于宿主细胞。HBV复制过程中很多步骤的完成都需要宿主因子的参与，例如由rcDNA分子到cccDNA这个过程就有宿主的DNA损伤修复系统的很多分子参与；另一方面，外源的病原体进入到机体之后，宿主要产生防御性的保护作用，即所谓的天然免疫，因此从这两个方面都可以制定一些相应的策略。2014年Science杂志和2016年Nature杂志分别报道了宿主抗病毒入侵的机制，其中Science杂志上的研究揭示了APOBEC3A和APOBEC3B这两个分子对于cccDNA的降解起了很重要的作用；Nature上的文章发现宿主名为Smc5/6的病毒复制限制因子结合到cccDNA微染色体，从而抑制cccDNA转录，而HBx可以引导该分子发生泛素化降解来对抗这种作用。。（3）针对病毒复制周期的清除新策略，例如针对病毒入侵的环节的入胞抑制剂。由于HBV通过preS-1与肝细胞上的受体NTCP发生作用，因此用preS1模拟多肽来封闭或阻断HBV进入的通道可以阻断HBV感染。但是NTCP除了与preS1结合外，在正常情况下也负责胆酸的运输，因此在体内还有其他的小分子化合物可以跟NTCP发生相互作用。这已成为开发新策略的一个热点，即寻找一些能够跟NTCP发生相互作用的小分子化合物，从而封闭HBV进入细胞的通道，起到阻止HBV感染的作用。针对cccDNA环节也可以开发新策略。我们知道，cccDNA是由rcDNA转变而来的。虽然这个转变过程的机制还未完全阐明，但是阻断这个过程一定能阻断HBV的复制，并且是比较彻底的一种方式。沉默cccDNA的表达或者诱导/促进cccDNA的降解也可达到同样的目的。此外，靶向病毒的药物的开发主要还集中在如何抑制核衣壳的组装方面，目前大多处于临床前或者临床试验当中。其理论依据是核衣壳是HBV DNA合成非常关键的场所，一旦核衣壳组装出了问题，HBV复制一定也会受到相应的影响。

 

　　综上所述，虽然目前已经有了以上这些直接和间接的清除HBsAg新策略，但是尚没有非常鼓舞人心的结果，HBV治疗新策略的研究仍然在探索当中。

 

　　关于HBsAg清除的新策略新机制研究的新进展

 

　　WHO发布的新千年可持续发展的目标和规划是本次会议上热议的话题，WHO的目标是到2030年能够消灭HBV。WHO制定这个目标应该是经过充分论证且可能实现的，实现这一目标具体包含了两层含义：第一，如何阻断HBV在人群中的传播，或者是消除HBV对人类健康构成的威胁。在这方面，由于疫苗的接种、核苷（酸）类药物抑制病毒复制的效果明显、感染孕妇接受短期抗病毒治疗阻断母婴传播的效果显著，因此，从技术的角度讲，实现降低新发感染是没有问题的。第二，对已经带有病毒的感染者和现症患者，如何清除体内的病毒颗粒。由于现有药物只能抑制病毒而非清除病毒，因此我们课题组主要集中在清除HBV或者HBsAg的一些新机制、新策略研究。通过十二·五的研究，主要形成了“1+2+X”的系列成果，以下重点介绍两项成果。

 

　　首先是厦门大学夏宁邵教授牵头的针对HBsAg的人源化抗体的研制开发。从目前药理学实验结果来看，课题组在实验动物中取得了非常鼓舞人心的结果。团队开发的抗体可以抑制和降低HBsAg的分泌和表达，长期使用可以预防肝癌的发生以及部分逆转免疫耐受。在机制方面也有重大的理论发现。我们采用冷冻电镜对抗原抗体复合物进行精细解析，发现抗体识别的表位跟传统中和表位不一致，其识别的表位并不在所谓的中和区域内，而是在靠近中和表位的位置，由此形成的抗原抗体复合物体积非常小，非常便于中性粒细胞和巨噬细胞吞噬，这也很好地解释了它中和活性比较强的原因。同时这项成果在产业化方面的推进也比较顺利。目前全人源化抗体的工作已经完成，相关实验表明其具有和鼠源性的抗体相似的药效学作用，该工作同时还得到了一些国际大公司的密切关注。

 

　　另一项是清华大学薛定教授牵头的利用线虫开展的HBV相关研究。薛定教授课题组利用线虫模型，得到一个HBx转基因表型，发现其可诱导线虫神经元细胞的凋亡，并且揭示了其中的机制。基于这个表型，团队采用了两种策略：首先，采用遗传学方法抑制这种表型，筛选到了一些抑制子，这些抑制子不但在线虫模型上验证有效，同时在人和小鼠模型上也证实有效，首次奠定了线虫可以用于HBV相关研究的基础。第二，在线虫模型中，我们筛选到一些小分子化合物可以增强这种表型。进一步在HBV转基因小鼠动物模型中，我们观察到这些小分子化合物可以选择性地杀伤HBV复制的肝细胞，而对正常肝细胞则没有明显的毒副作用。这种靶向感染肝细胞的新策略可能是更具开发前景的策略，相关研究也正在紧张开展中。

 

　　肝内cccDNA的残留是患者停药复发的关键

 

　　在判定慢性乙肝停药复发和影响因素方面，需要明确以下三个方面的问题：

 

　　（1）HBsAg的清除不代表HBV的清除。因为HBsAg仅是肝内HBV的复制在外周的一种表现，所以它是“果”，而不是“因”。“因”是感染肝细胞当中的cccDNA。

 

　　（2）HBV清除之后仍然可能在血清当中检测出HBsAg。原因在于HBV可以整合到宿主肝细胞的染色体，特别是HBsAg区段整合到染色体的几率更大。因此，即使肝细胞的cccDNA已经被清除了，但是染色体当中的片段仍然可以表达HBsAg并分泌到血清当中。这种情况下的HBsAg表达并不会引起病情的复发或者异常。

 

　　（3）HBV抗病毒治疗停药后是否复发的关键，一是在于肝内是否存留有cccDNA，二是存留的cccDNA是否处于激活状态；也就是说，本质上取决于肝内cccDNA的数量和功能状态。cccDNA在一个细胞里面的量要减少, 一是靠细胞分裂，二是靠降解。肝细胞在正常情况下是不分裂的，只有在受到损伤的情况下才可能分裂。而cccDNA能否有效降解，可能与宿主的免疫状态有关。在功能状态方面，cccDNA可能不只有一种功能状态，比如cccDNA可能会发生一些表观遗传学修饰或发生了突变，继而影响到其功能状态是抑制还是激活，从而决定是否复发。