闫惠平首都医科大学附属北京佑安医院
编者按：自身抗体是指抗细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白，迄今为止已经发现上百种自身抗体，它们是自身免疫性肝病诊断的重要指标。在刚刚结束的第九届全国疑难及重症肝病大会上，首都医科大学附属北京佑安医院闫惠平教授作专题报告，介绍了自身抗体检测技术及临床问题。本刊特邀闫教授撰稿，帮助大家系统学习相关知识。
自身抗体是自身免疫性肝病诊断的重要指标。本文从三个层面简单介绍自身抗体检测技术以及由此产生的一些问题，望有助于大家的临床诊治工作。
什么是自身抗体？
自身抗体（autoantibody) 是指针对自身细胞内、细胞表面或细胞外抗原的免疫球蛋白。迄今为止人类已经发现了上百种自身抗体。自身抗体与自身免疫疾病对应关系比较复杂，一种疾病可以出现多种自身抗体，比如系统性红斑狼疮相关的自身抗体就达100多种；同时，一种自身抗体也可能见于多种疾病[1]。
自身抗体有多种分类方法：例如，依据是否具有特异性分为器官/组织特异性自身抗体和非器官组织特异性自身抗体；根据抗原位置分为抗细胞自身抗体和抗组织自身抗体；或依据其对疾病诊断的作用还可以分为疾病标志性自身抗体、疾病特异性或疾病相关自身抗体等。了解以上知识可以帮助我们更好地评估自身抗体的作用。
目前常用的自身抗体检测技术和特点
在20世纪70年代，自身抗体的检测建立在间接免疫荧光法(IIF)出现的基础上。时至今日，当年采用这种方法检测的许多项目逐渐被自动化仪器所替代，而在自身抗体检测中IIF方法一直沿用至今。尤其是抗核抗体（ANA）的检测，由于需要观察荧光核型的特殊图像，IIF方法仍是国内外多个指南中推荐的ANA筛查方法。此法可以多项组合、以细胞或组织为基质筛查出多种自身抗体；但需要有经验的人员和高质量的荧光显微镜；不同医院的结果可能存在差异。
酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法、Western Blot(WB)、线性免疫分析等技术也用于临床自身抗体的检测。近几年，自身抗体试剂生产企业迅速增多，半自动乃至全自动的化学发光仪、酶免分析仪等仪器均已开始临床应用。
自身免疫肝病相关自身抗体目前主要以IIF、免疫印迹和ELISA方法检测。采用IIF法检测ANA时，检测应该报告抗体滴度和核型。核型的分类可以依据“ANA核型的国际共识”[2],报告位于细胞核的核均质型、核颗粒型、着丝点型、核仁型等和位于胞浆的高尔基体型、溶酶体型等；也可以采用荧光显微镜结合电脑成像系统软件，初步分析ANA的荧光核型，不过其对ANA复杂图像的识别与人脑尚有很大差距。
ELISA用于检测AMA-M2抗体、PBC特异的ANA(抗sp100,抗gp210)、AIH特异的抗可溶性肝抗原（抗SLA）等多种自身抗体。其优点为相对定量，可高通量检测，但不易组合。
免疫印迹法可以检测数十种ANA谱系和自身免疫肝病谱系的自身抗体，多项目组合，操作简便，但某些项目敏感性稍低。
新指南有关PBC和AIH的自身抗体检测要求
原发性胆汁性胆管炎（PBC）
2017年EASL关于PBC的指南[3]推荐，对不能解释原因的所有胆汁淤积病例，采用IIF进行血清学AMA和PBC特异性ANA筛查。
AMA是PBC诊断标志性自身抗体，结合胆汁淤积的指标，对PBC诊断具有特异性。但AMA也见于某些系统性疾病以及正常人群。
“PBC特异性ANA”，是指采用间接免疫荧光法观察核型为核点型（nuclear dots）和核周型(perinuclear rims)（或称核包膜型，nuclear envelope）；或ELISA或蛋白质杂交（WB）方法检测抗Sp100（可溶性酸性磷酸化核蛋白，是核点型ANA的靶抗原之一）和抗gp210（分子量210 KDa的跨膜糖蛋白，是核包膜型ANA的靶抗原之一）。抗Sp100和抗gp210对PBC的特异性＞95%。主要用于5%~10%的AMA阴性的PBC患者的诊断及对于疾病严重程度的评估。
从方法学角度，笔者建议临床需要注意两个问题：①不能仅仅以WB法AMA-M2阴性的结果诊断患者为“AMA阴性PBC”，应采用更敏感的方法联合检测来确诊。②不能仅依据AMA和ANA高滴度阳性的结果诊断患者为AIH/PBC重叠综合征。因为“PBC特异性ANA”往往也呈高滴度（强阳性）阳性，但其并不提示患者同时伴有其他自身免疫疾病。
自身免疫肝炎（AIH）
AIH患者可以检测到多种自身抗体，但大多均为非特异性自身抗体（ANA或ASMA）[4]。EASL有关AIH的指南[5]中也推荐了检测自身抗体的方法学：ANA、ASMA、LKM和LC-1抗体推荐使用IIF检测，抗SLA推荐使用ELISA或WB检测。可见正确选择方法学对自身抗体的检测准确程度至关重要。
IIF检测AIH患者的ANA荧光核型，欧洲报道以核均质型和核颗粒型较多见，我们在临床所见与其类似，但有40%以上表现为混合型。这些荧光核型对应的靶抗原可能为单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)、组蛋白（histones）等，并非AIH的自身靶抗原[6]。AIH缺乏特异性标志物，导致其确诊存在一定的难度。研究AIH的新自身抗体很有必要。
总之，我们需要充分认识自身抗体的临床意义，其不仅起到诊断与鉴别诊断作用，也可能预测疾病。正如EASL的PBC指南中指出，AMA单独阳性尚不足以诊断PBC。推荐对血清肝功正常的AMA阳性者进行随访，每年检测生化指标对肝病的存在进行评估，以期对患者早发现早治疗。
参考文献
1.James B. Peter and Yehuda Shoenfeld. Autoantidodies (Second Edition). 2007, Elsevier, Amsterdam
2.Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns (ICAP) 2014-2015 Front. Immunol. 2015, Aug 20;6:412
3.European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines: The diagnosis and management ofpatients with primary biliary cholangitis. J Hepatol (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.jhep.2017.03.022
4.自身免疫性肝炎诊断和治疗共识。中华医学会肝病学分会、消化疾病学分会、感染性疾病学分会，临床肝胆病杂志，2016，32（1）：9-22
5.EASL Clinical Practice Guidelines: Autoimmune hepatitis.J Hepatology, 2015,63:971-1004
6.Rodrigo Liberal, Diego Vergani and GiorginaMieli-Vergan.Update on Autoimmune Hepatitis. J Clinical and Translational Hepatology, 2015, 3: 42-52