AASLD中国之声丨丁建强教授：证实干细胞移植治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的可行性

—— 作者: 时间:2021-03-30 05:49:16 阅读数: 4

α-1抗胰蛋白酶缺乏症是一种常染色体共显性遗传性肝病，晚期常常表现为肝肺功能衰竭，但供体器官严重缺乏，干细胞移植是一种潜在的治疗选择，但是干细胞肝向分化的肝细胞样细胞存在着分化不完全、成熟度低、肝细胞功能不完善和增殖能力可疑等问题。

2020年肝病研究学会（AASLD）年会上，我国学者、南方医科大学顺德医院感染病科丁建强教授团队的一篇口头报告证实了干细胞移植用于α-1抗胰蛋白酶缺乏症的可行性（摘要编号：33）。《国际肝病》特邀丁教授对该项研究做详细介绍，内容整理如下。

肝定向分化诱导多能干细胞在人α-1抗胰蛋白酶缺乏症转基因小鼠肝脏内的再生

研究目的：α-1抗胰蛋白酶缺乏症是一种常染色体共显性遗传性肝病，晚期常常表现为肝肺功能衰竭，但供体器官严重缺乏，干细胞移植是一种潜在的治疗选择，但是干细胞肝向分化的肝细胞样细胞存在着分化不完全、成熟度低、肝细胞功能不完善和增殖能力可疑等问题。在本研究中，我们将人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）进行肝定向分化，将尚未完全分化成熟的干细胞（hepatic-specified stem cell）经脾注射方法移植到α-1抗胰蛋白酶缺乏症转基因小鼠的肝脏内，1、3和6个月后肝活检进行干细胞定植与增生情况的研究。

材料和方法：转基因动物由人肝细胞表达α-1抗胰蛋白酶基因的固有启动子和“Z”突变cDNA质粒使用常规显微注射方法自行制备完成。人iPS干细胞DYR0100购自美国ATCC，使用mTeSRTM1干细胞培养液，在matrigel包被的6孔板上进行干细胞的培养，在长满前加Activin A (100 ng/ml)到RPMI+B27培养液20%O2培养5天，然后改为RPMI+B27加BMP-4 (20 ng/ml)和FGF-2 (10 ng/ml)在4%O2培养5天，最后用StemPro Accutase收集细胞用于移植。移植前1周，FK506溶于饮用水中，给予成年鼠1μg/克体重/天。100万干细胞经脾注射移植到肝脏，1、3和6个月后活检肝脏，使用HSA和AAT抗体进行免疫荧光染色。用竞争性ELISA试剂盒检测小鼠人血清HSA含量。抗体OCT3/4、SOX17、FOXA2、AFP、ALB、SSEA4（R&D SYSTEMS）和GATA-4、HNF-4α、ASGPR1、CK-18、CK-19（Santa Cruz）用于干细胞的免疫荧光染色。抗人AAT抗体sc-3012（Santa Cruz）。

图1.pRPexp-Vector map

结果：DNA序列分析证实了α-1抗胰蛋白酶基因克隆及“Z”突变。小鼠基因分型由PCR反应证实。D/PAS染色显示肝细胞内大小不等阳性红色颗粒。2阶段定向分化后的干细胞免疫荧光染色显示干细胞特性的逐渐减弱或消失，同时肝细胞特性逐渐出现。1、3和6个月干细胞移植后肝组织的HSA和AAT共染色显示移植细胞不同程度的增殖，iPS干细胞和hepatic-specified干细胞在转基因小鼠肝脏内的增殖未见明显差异，B6小鼠肝内未见阳性克隆。1、3和6个月细胞移植后小鼠血清中人血浆白蛋白浓度分别是20.33 ng/ml、91.44 ng/ml、431.44 ng/ml（iPS干细胞组）和18.11 ng/ml、82.00 ng/ml、464.22 ng/ml（hepatic-specified干细胞组），两组之间未见明显差异（P>0.05)。