肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要类型，在我国肝癌患者中占75%～85%^[1]。近年来，尽管对HCC的诊断和治疗策略有了长足进展，进一步提高患者预后的研究却并未止步，深入阐明HCC发病和进展的肿瘤特异性机制，对于寻找HCC新的治疗靶点、制定治疗策略至关重要。其中，关于非编码RNA（ncRNAs）在HCC癌变中的重要作用越来越引起人们的关注。

 

2011年，Salmena等人提出了一个竞争性内源RNA（ceRNA）的假说，即mRNAs、长链非编码RNA（lncRNAs，>200 bp）和其他ncRNAs共享同一个miRNA应答元件（MREs），它们通过与靶向mRNA上的MREs竞争性结合，来抑制miRNA的生物功能^[2]。新的研究表明，lncRNAs在细胞质中可以维持mRNA的稳定或作为ceRNA来调节蛋白质水平^[3]。

 

由于lncRNAs和mRNAs具有良好的特异性和可及性，能否将其作为肝癌潜在的诊断、预后预测的生物学标志物已成为该领域的一大研究热点。近日，中国中医科学院中药研究所张彦琼研究员及其团队通过研究，发现了一个新的lncRNA-TUG1-microRNA-328-3p-SRSF9 mRNA轴参与HCC的发生，从而为HCC的靶向预后和治疗提供了有意义的线索^[4]。该项研究成果发表在肿瘤学基础研究领域的顶级期刊Molecular Cancer杂志（IF：27.401；CR分区：Q1）。

 

（文章发表封图）

 

LncRNA TUG1?miR?328?3p?SRSF9 mRNA轴的失调与HCC进展、患者预后相关

 

研究人员使用微阵列（GSE166163）分析了HCC患者的肝癌组织及癌旁正常组织中lncRNA、miRNA和mRNA表达谱。结果显示，与正常组织相比，癌组织中约有1169个lncRNAs、89个miRNAs和1766个mRNAs的表达存在差异，其中，hsa-miR-328-3p的表达显著下调，而高表达的SRSF9 mRNA则成为hsa-miR-328-3p的候选靶点之一。通过MiRanda生物信息学算法，研究人员筛选出与hsa-miR-328-3p相同3′-UTR位点、与SRSF9 mRNA结合的lncRNA——牛磺酸上调基因1（TUG1），它在肝癌组织和癌旁非癌肝组织中的差异性表达趋势也与SRSF9 mRNA一致。此外，双荧光素酶报告基因分析证实，SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1都是具有相同结合位点的hsa-miR-328-3p的靶点（见图1）。

 

图1. 基于293 T细胞进行双荧光素酶报告基因分析，矩形标记的基因序列表明SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1与miR-328-3p具有相同的结合位点

 

既往研究表明，TUG1是在血管内皮细胞中高表达的lncRNA，主要作用为调控肿瘤细胞的增殖和凋亡，是潜在的肿瘤生物标志物及治疗靶点。此外，TUG1在上皮-间质转化（EMT）过程中也发挥着重要功能，TUG1抑制能够通过逆转EMT抑制体外转移潜能。

 

为了证实肝癌中lncRNA TUG1、miR-328-3p和SRSF9 mRNA的异常表达模式，研究人员在验证队列中进行了分析其结果与基于发现队列的微阵列数据一致（图2A）。此外，根据Kandall和Spearman分析，在癌组织中观察到miR-328-3p和SRSF9 mRNA表达水平，以及SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1表达水平之间的显著相关性（图2B）。

 

图2. LncRNA TUG1-miR-328-3p-SRSF9 mRNA ceRNA轴的失调参与HCC的发生

A. 与相应的非癌肝组织（n=56）相比，HCC组织（n=77）中SRSF9 mRNA、miR-328-3p和lncRNA TUG1的相对表达水平。与非癌组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。B. HCC样本SRSF9 miR-328-3p和SRSF9 mRNA表达水平之间，以及SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1表达水平之间的Kandall和Spearman相关性分析。C. SRSF9 mRNA表达可能与HCC患者的总生存率和无病生存率显著相关。D. lncRNA TUG1-miR-328-3p-SRSF9 mRNA轴参与HCC进展的示意图模型。E、F、H、I，SRSF9过表达逆转miR-328-3p在HUH7细胞增殖和迁移活动中的肿瘤抑制作用。G、J、K， 流式细胞仪检测pre-SRSF9 mRNA+mimics-miR-328-3p转染的HUH7细胞的细胞凋亡和细胞周期。

 

随后，研究人员进一步评估了SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1在HCC中表达的临床意义。结果发现，男性HCC患者中SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1过度表达的发生率均高于女性。SRSF9 mRNA和lncRNA TUG1的高表达与术前血清甲胎蛋白（AFP）水平和高肿瘤分级显著相关。重要的是，Kaplan-Meier生存曲线分析表明，SRSF9 mRNA高表达的HCC患者与低表达组相比，总体预后和无病生存率较差（P值均<0.05）（图2C）。

 

SRSF9 mRNA的抑制和miR-328-3p的上调能有效抑制HCC细胞的增殖、迁移和细胞周期，并诱导HCC细胞凋亡

 

为了深入了解SRSF9 mRNA和miR-328-3p在HCC细胞恶性肿瘤中的生物学功能，研究人员通过体外试验，分别将针对SRSF9 mRNA基因转录的特异性siRNAs和稳定上调miR-328-3p内源性表达的质粒成功导入HUH7和MHCC97H细胞。结果表明，SRSF9 mRNA的低表达和miR-328-3p的上调均显著抑制了肝癌细胞的增殖能力，降低了细胞的迁移能力，此外它们导致细胞周期停滞在G1期，并显著增加了凋亡HCC细胞的百分比。

 

SRSF9修复逆转miR-328-3p对HCC细胞的抑制作用

 

为了验证miR-328-3p对SRSF9 mRNA在体外发挥抗肝癌作用时的调节作用，研究人员构建了miR-328-3p和SRSF9 mRNA共过表达质粒，并分别导入HUH7和MHCC97H细胞。结果发现，导入miR-328-3p和SRSF9 mRNA共过表达质粒的HCC细胞中SRSF9蛋白的表达水平明显高于单独使用miR-328-3p过表达质粒的HCC细胞。在功能上，与对照组相比，在HUH7和MHCC97H细胞中单独上调miR-328-3p，导致HCC细胞增殖能力下降、细胞凋亡增多，以及细胞迁移潜能的下降；与此相反，在HUH7和MHCC97H细胞中共转染miR-328-3p和SRSF9 mRNA，获得了相关参数的显著逆转。

 

LncRNA TUG1通过结合miR-328-3p，可消除miRNA-328-3p对SRSF9 mRNA的负调控

为了进一步验证lncRNA TUG1在影响miR-328-3p对HCC中SRSF9 mRNA的干预作用，研究人员将过表达miR-328-3p和lncRNA TUG1的质粒共转染到HUH7和MHCC97H细胞中，结果表明，SRSF9蛋白的表达水平明显高于单独使用miR-328-3p过表达质粒的表达水平，这意味着lncRNA TUG1可显著降低miRNA-328-3p对HCC细胞中SRSF9表达的负调节作用。与miR328-3p和SRSF9 mRNA共过表达组的研究结果相似，miR-328-3p和lncRNA TUG1的联合过表达显著减弱了miR-328-3p在HCC细胞中的肿瘤抑制作用。

 

最后，研究人员还通过构建一个稳定的DEN诱导的大鼠肝纤维化-肝硬化-HCC疾病进展模型和皮下异种移植的裸鼠HCC模型，通过体内试验证实了lncRNA TUG1miR3283pSRSF9 mRNA轴的异常调节可能参与体内HCC生长，并且可通过复方鳖甲软肝片来恢复。

 

参考文献：

 

1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.

 

2. Zhong Y, Yajun D, Yang X, Mo Y, Fan C, Xiong F, et al. Circular RNAs function as ceRNAs to regulate and control human cancer progression. Mol Cancer. 2018;17(1):79.

 

3. Qi X, Zhang D-H, Nan W, Xiao J-H, Wang X, Ma W. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. J Med Genet. 2015;52(10):710–8.

 

4. Liu Y, Mao X, Ma Z, et al. Aberrant regulation of LncRNA TUG1-microRNA-328-3p-SRSF9 mRNA Axis in hepatocellular carcinoma: a promising target for prognosis and therapy. Mol Cancer. 2022 Feb 4;21(1):36.