高强 王晓晶 宁琴

 

华中科技大学同济医学院附属同济医院

 

编者按

 

近年来，全球非酒精性脂肪性肝病（NALFD）的发病率不断增高，已经成为全世界慢性肝病的最常见原因，且在全球范围内的患病率不断增加。在我国发达地区，成人NAFLD患病率高达15%，成为我国慢性肝病的首要原因。目前，NALFD的治疗以改善代谢综合征为主，尚缺乏通过广泛临床研究验证的治疗药物。近年来随着对其发病机制的深入理解，一些尚处于动物试验及前期临床研究的新药值得关注。在第32届亚太肝脏研究协会（APASL）年会上，我国华中科技大学同济医学院附属同济医院宁琴教授团队报告了一项最新的研究进展，为NAFLD的临床治疗提供了新的干预策略。

 

NAFLD疾病负担与危害

 

NAFLD是全球范围内最主要的慢性肝病之一，总患病率约32.4％^[1]。在我国，NAFLD的患病率从20世纪初的23.8％上升至2018年的32.9％，已成为我国最常见的肝脏疾病^[2]。

 

NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。其中NAFL的特征是大于5％的肝脏发生脂肪变性而不伴有明显的炎症和肝细胞损伤，是临床NAFLD最常见的类型。10%-25％的NAFLD患者会进展为伴有肝脏炎症和细胞损伤的NASH阶段，进展后的患者发生肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的概率显著增加^[3]。庞大的人群基数加上逐年增加的患病率，使得NAFLD成为世界范围内亟待解决的公共健康问题^[4]。

 

尽管目前在阐明NAFLD发病机制、明确治疗靶点和推进药物开发方面已经取得一定的进展，但NAFLD肝脏脂质沉积、炎症损伤的确切机制仍不清除，极大地限制了临床药物的开发^[5]。因此，深入解析NAFLD脂质沉积、炎症损伤的确切机制和影响因素是推进NAFLD临床药物开发的前提条件。

 

自噬参与NAFLD肝脏脂质沉积和炎症损伤

 

自噬（Autophagy，特指巨自噬）是细胞在应激情况下启动的一种高度保守的分解代谢过程，作为细胞内的质量控制系统降解受损的细胞成分，为应激细胞提供能量，通常被认为一种细胞保护机制^[6]。大量的研究已经证明，自噬功能异常是NAFLD发病机制中的重要组成部分。

 

在肝细胞内，自噬可以通过降解脂滴直接参与脂质代谢^[7]，也可通过维持参与脂质代谢细胞器和蛋白酶的正常功能间接参与脂质代谢^[8]。然而在NAFLD长期慢性脂质刺激下，肝细胞自噬功能异常，这可能是NAFLD肝细胞内脂质沉积的内在机制之一。

 

另一方面，自噬与炎症之间存在着密切的关系，自噬可以通过降解细胞内炎性小体等重要炎性通路的分子抑制炎症，也可通过清除炎症刺激因素（细菌、病毒、受损细胞器或蛋白质等）、抑制免疫细胞炎性表型或抑制STING活化等机制对抗细胞炎症损伤^[9]，还可以通过分泌性自噬、外泌体、NETS等方式介导炎症信号在细胞间的传递^[10]。在NAFLD肝脏内，自噬与炎症的关系得到了大量研究的证实，自噬的改善有利于对抗肝脏炎症损伤和纤维化进展。

 

目前，已发表的NAFLD肝脏自噬异常机制研究涉及自噬上游调控、自噬小体成熟、自噬小体和溶酶体融合以及溶酶体功能等方面，囊括了整个自噬通路。其中大部分研究集中在自噬上游调控方面，HIF-1α、Rubicon、MTOR、AMPK、TFEB和ATG7等上游蛋白分子受到广泛关注，但到目前为止仍没有确证可用于临床的干预措施，而自噬小体成熟、融合以及溶酶体功能方面的研究比较缺乏。

 

NPC1突变诱导自噬异常和肝脂肪变性

 

胆固醇转运蛋白NPC1是位于溶酶体和晚期内体膜上的跨膜蛋白，在可溶性胆固醇转运蛋白NPC2的协助下转运来自晚期内体内膜上溶血双磷脂酸（LBPA）结合的胆固醇。晚期内体和溶酶体膜上NPC1共同作用，调控细胞内胆固醇和脂质重新分布，参与细胞内脂质代谢平衡。在人类中，全基因组关联研究证实了NPC1常见变异在成人肥胖和2型糖尿病中的重要意义，NPC1杂合子突变增加了成人肥胖的风险。

 

NPC1基因突变后，会导致一种罕见的遗传性神经内脏疾病——尼曼匹克病（NPCD），表现为肝脾肿大和随后的神经退行性变，肝肿大源自于细胞内胆固醇和脂质沉积，属于溶酶体贮积症（LSD）。有意思的是，NPC1突变细胞不仅具有与NAFLD细胞相似的的脂质沉积和炎症损伤，自噬变化也与NAFLD细胞非常相似，都表现为明显的自噬小体标志物LC3II和自噬降解底物P62的显著增加，提示自噬通路下游（自噬小体和溶酶体融合或溶酶体降解）异常。

 

此外，LBPA是NPC1转运胆固醇的上游分子，不仅结合胆固醇和其他脂质增加胆固醇和脂质转运速率，还具协助胰岛素样生长因子2受体（IGF-2R）进行蛋白质分选的功能，参与细胞新合成蛋白的分选和转运，也极有可能参与了溶酶体酶蛋白的分选，影响溶酶体功能。不仅如此，DOPG（LBPA前体）或Thioperamide（被证明可以增加细胞内LBPA水平）刺激可以显著改善NPC1突变诱导的细胞自噬异常和脂质沉积。

 

NAFLD小鼠和细胞模型自噬异常，NPC1和LBPA水平降低

 

基于以上背景，我们很容易将NAFLD肝内自噬异常与NPC1突变细胞内自噬异常联系起来。为了证实这种推测，我们通过高脂饮食（HFD）喂养16周和棕榈酸（PA）体外刺激THP1或LO2细胞系建立NAFLD小鼠和人细胞模型。与大部分前人的研究一致，自噬小体标记物LC3II和自噬底物P62在NAFLD组显著增加，自噬上游调控蛋白P-AMPK、Beclin-1、ATG7和PI3K等都没有明显的变化，一致地说明NAFLD内自噬异常位点很可能在自噬通路下游。后续通过自噬上游激动剂雷帕霉素（RAPA）体内外刺激NAFLD小鼠和细胞模型也证实了单纯刺激自噬上游并不能明显改善NAFLD诱导的自噬异常和脂质沉积。

 

接下来，我们检测了NAFLD小鼠肝脏NPC1和LBPA水平，免疫荧光和Western结果都表明，NPC1和LBPA在NAFLD组显著降低（图1），同时LBPA抗体和NPCD细胞模型诱导剂U18666A在体外诱导了细胞LC3II和P62的升高，进一步证实了这种联系的可能性。

 

图1. NAFLD小鼠肝脏NPC1表达显著下降

 

靶向NPC1或LBPA在体外改善NAFLD细胞自噬

 

为了进一步证实NAFLD肝脏NPC1或LBPA缺乏与自噬异常的关系，我们针对NPC1或LBPA筛选出3个干预分子：羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD，改善NPC1功能）、DOPG（LBPA前体，补充LBPA）和Thioperamide（刺激细胞LBPA水平升高）。在体外，这三种分子都可以一定程度改善NAFLD诱导的自噬异常，但通过重复实验发现针对LBPA的方法具有更明显的效应（图2）。

 

图2. 靶向NPC1或LBPA的刺激体外改善NAFLD细胞自噬受损

 

Thioperamide合并RAPA显著改善HFD诱导的小鼠肝脏脂质沉积

 

基于体外实验结果，我们通过腹腔注射的方式对DOPG和Thioperamide在体内的作用进行了检测。结果表明单纯DOPG或Thioperamide并不能明显改善HFD诱导的小鼠肝脏脂肪变性，但确实增加了肝脏细胞内LBPA的水平。而合并自噬上游激动剂RAPA可以显著改善NAFLD小鼠肝脏脂肪变性，其中Thioperamide合并RAPA的作用更明显（图3）。后续电镜检测发现HFD组小鼠肝细胞内自噬小体积累，Thioperamide处理后自噬下体显著下降，Thioperamide合并RAPA处理后自噬小体较单纯Thioperamide处理增加，并且细胞内形成了特殊的多板层体结构，还可以发现受损的细胞器进入到单层囊泡内降解的现象。

 

这些结果表明，LBPA缺乏参与了NAFLD小鼠肝脏自噬下游异常的形成，靶向LBPA是一种可行的通过改善自噬功能改善NAFLD的策略。但由于NAFLD肝脏自噬上游并未激活，需结合自噬上游激动剂增加自噬通量，联合改善NAFLD肝脏脂质沉积。

 

图3. Thioperamide合并雷帕霉素显著改善饮食诱导的小鼠NAFLD

 

END

 

参考文献：

 

1. Riazi K, Azhari H, Charette JH, Underwood FE, King JA, Afshar EE, Swain MG, et al. The prevalence and incidence of NAFLD worldwide: a systematic review and meta-analysis. Lancet Gastroenterol Hepatol 2022;7:851-861.

 

2. Zhou J, Zhou F, Wang W, Zhang XJ, Ji YX, Zhang P, She ZG, et al. Epidemiological Features of NAFLD From 1999 to 2018 in China. Hepatology 2020;71:1851-1864.

 

3. Vanni E, Bugianesi E, Kotronen A, De Minicis S, Yki-J?rvinen H, Svegliati-Baroni G. From the metabolic syndrome to NAFLD or vice versa? Dig Liver Dis 2010;42:320-330.

 

4. Lazarus JV, Mark HE, Anstee QM, Arab JP, Batterham RL, Castera L, Cortez-Pinto H, et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: a consensus statement. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2022;19:60-78.

 

5. Sheka AC, Adeyi O, Thompson J, Hameed B, Crawford PA, Ikramuddin S. Nonalcoholic Steatohepatitis: A Review. Jama 2020;323:1175-1183.

 

6. Dikic I, Elazar Z. Mechanism and medical implications of mammalian autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol 2018;19:349-364.

 

7. Singh R, Kaushik S, Wang Y, Xiang Y, Novak I, Komatsu M, Tanaka K, et al. Autophagy regulates lipid metabolism. Nature 2009;458:1131-1135.

 

8. Byrnes K, Blessinger S, Bailey NT, Scaife R, Liu G, Khambu B. Therapeutic regulation of autophagy in hepatic metabolism. Acta Pharm Sin B 2022;12:33-49.

 

9. Deretic V. Autophagy in inflammation, infection, and immunometabolism. Immunity 2021;54:437-453.

 

10. Matsuzawa-Ishimoto Y, Hwang S, Cadwell K. Autophagy and Inflammation. Annu Rev Immunol 2018;36:73-101.

 

 

专家简介

 

宁琴

 

国家重大公共卫生事件医学中心副主任

 

感染科教研室主任、感染科主任、感染病研究所所长

 

国家杰出青年科学基金获得者（2002）、长江学者特聘教授（2019）

 

“973”首席科学家（2007）

 

传染病重大专项与重点研发项目首席科学家（2013、2017、2021）

 

卫生部有突出贡献中青年专家

 

中华医学会感染病学分会副主任委员

 

《感染病学》专著及全国统编教材主编、副主编

 

牵头完成专家诊治共识6部

 

Elsevier“中国高被引学者”（2021、2022）

 

国内外发表文章400余篇（BMJ，JH，STTT，Lancet GH，JCI等）

 

 

专家简介

 

王晓晶

 

华中科技大学同济医学院附属同济医院研究员

 

同济医院感染科科研副主任

 

国家“万人计划”青年拔尖人才

 

研究领域： 

 

非酒精性脂肪性肝病发病机制及治疗策略

 

病毒性肝炎肝损伤的免疫学机制及干预策略

 

慢乙肝合并脂肪肝的免疫及代谢机制

 

2014年于华中科技大学获得医学博士学位。曾受国家公派赴美国麻省大学医学院从事博士后工作，师从前美国肝病学会主席、著名肝脏病学家Gyongyi Szabo教授。先后主持承担国家自然科学基金 2项，国家卫健委“十三五”重大专项子课题，作为学术骨干参与科技部“十四五”重点研发计划 。作为主要参与者参加了多项国自然重点/面上项目，教育部创新团队发展计划，以及科技部973 计划等国家级重大项目的研究工作。发表SCI论文30余篇，合计影响因子>200，其中2篇IF>20分（Cellular&molecular immunology，Clinical Infectious Disease），2篇IF>10分（Hepatology，Theracostics）。

 

 

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