编者按

 

2023年11月10日～14日，2023年美国肝病研究学会年会（AASLD2023）在美国波士顿隆重举行。上海交通大学医学院附属新华医院消化内科范建高教授团队多项研究成果被大会收录，其中一篇以口头报告的形式在会上进行了展示（oral 29），团队曾静医师更是荣获了两项AASLD大奖——“2023 Fellow Abstract Award”和“2023 Leonard B. Seeff Award”，在此表示热烈的祝贺！《国际肝病》特别邀请到范建高教授介绍团队最新科研成果并点评代谢相关脂肪性肝病等领域的重要进展和热点话题，邀请曾静医师分享获奖感受和国外学习交流体会。访谈视频和部分研究内容分享如下。

 

▲曾静医师（左）荣获“2023 Fellow Abstract Award”和“2023 Leonard B. Seeff Award”

 

研究一

肝硬化患者肠道中与氧耗和炎症有关的基因表达与肝病进展相关

 

29: ALTERED SMALL AND LARGE INTESTINAL GENE EXPRESSION RELATED TO OXYGEN CONSUMPTION AND INFLAMMATION IN PATIENTS WITH CIRRHOSIS COULD CONTRIBUTE TOWARDS DYSBIOSIS AND LIVER DISEASE PROGRESSION

 

第一作者：曾静；通讯作者：Huiping Zhou，Jasmohan S. Bajaj

 

研究背景

 

肠道中的氧气含量和炎症水平已被认为是肝病进展的重要因素。由于血流改变和氧气传递受损引起的肠道缺氧会触发炎症，并破坏肠道屏障，导致细菌移位，细菌移位及其产物到达肝脏，促进炎症、氧化应激和肝损伤。然而，在肝硬化患者中，氧耗、肠道炎症与肝病进展之间的关系仍然不明确。

 

研究方法

 

入组健康对照组、肝硬化代偿期和失代偿期肝硬化的年龄匹配的男性，并在同一天进行胃肠镜检查，并从十二指肠和升结肠中取活检。使用Trizol分离总RNA。基因谱分析使用NanoString nCounter?进行。使用Rosalind识别组间差异表达基因。

 

研究结果

 

生物信息学分析显示，与健康对照组相比，肝硬化患者的十二指肠和升结肠中与炎症有关的关键基因表达显著上调，与氧耗相关的基因同样表达显著上调，而与氧气反应相关的基因表达显著下调。此外，肝硬化失代偿期患者较肝硬化代偿期患者，表现出与炎症和氧耗有关的基因表达增加，与氧气反应有关的基因表达减少。

 

研究结论

 

我们发现在肝硬化患者中存在与氧耗相关的基因表达的变化，这种变化随着疾病的进展而增加。这可能促进了潜在厌氧致病菌在肠道中的生长，并且在理解肝硬化中肠道氧水平、炎症和肝病相互作用方面具有一定意义。

 

 

研究二

神经酰胺合成酶（CERS）家族及相关长链非编码RNA（lncRNA）在MASH-HCC中的影响

 

2377-C: THE CERAMIDE SYNTHASE (CERS) FAMILY AND RELATED LNCRNAS CONTRIBUTING TO NASH-HCC DISEASE PROGRESSION

 

第一作者：曾静；通讯作者：范建高，Huiping Zhou

 

研究背景

 

代谢相关脂肪性肝病（MASLD）从代谢相关脂肪性肝炎（MASH）发展到肝细胞癌（HCC）的潜在机制尚不清楚。神经酰胺合成酶（CERS）在MASH-HCC的发病机制中起到了作用。神经酰胺是MASH中脂质毒性的关键介质。长链非编码RNA（LncRNA） 是与肿瘤发生相关的基因表达的重要调节因子。然而，在MASH-HCC的发展中，CERS家族和与CERS相关的 lncRNA（CERSRLs）的具体作用仍然未知，是本研究的焦点。

 

研究方法

 

从TCGA数据库获取了HCC患者的RNA测序数据。在差异表达的lncRNA中进行共表达分析以识别CERSRLs。使用单变量Cox分析选择具有预后意义的CERSRLs，并构建预后模型。使用基于风险分数的Kaplan-Meier曲线进行模型验证。在动物研究中，使用DIAMOND NASH小鼠，对其进行6个月或1年的正常饮食或高脂饮食。使用液相色谱-串联质谱法定量测定了血清和肝脏中的神经酰胺谱。使用RNA测序鉴定重要的CERSRLs。

 

研究结果

 

在TCGA数据库中，与健康对照组相比，HCC中的CERS家族基因均显著上调。共表达分析确定了差异表达的CERSLs，构建了一个包含CERSLs的预后模型，高风险组中HCC预后较差。在小鼠模型中，所有实验组小鼠分别发展为 MASH和HCC。在人HCC和小鼠MASH-HCC中，识别出对MASH和HCC的 重要 CERSRLs，与小鼠中的对照相比。液相色谱-串联质谱数据显示MASH和HCC中 神经酰胺谱的显著变化。

 

研究结论

 

我们的研究揭示了CERS和CERSRLs在NASH和HCC进展中的关联。需要进一步研究CERSRLs在临床上作为诊断或预后标志的潜在应用。

 

 

研究三

循环外泌体miRNA和mRNA网络为重度酒精相关性肝炎（SAH）患者新的生物标志物发现以及治疗靶点提供潜在可能性

 

3580-C: NOVEL CIRCULATING EXOSOMAL MIRNAS AND mRNA NETWORK OFFERS PATHOPHYSIOLOGIC INSIGHTS AND POTENTIAL FOR NEW BIOMARKER DISCOVERY AND THERAPEUTIC TARGETS IN PATIENTS WITH SEVERE ALCOHOL ASSOCIATED HEPATITIS (SAH)

 

第一作者：曾静；通讯作者：Huiping Zhou，Puneet Puri

 

研究背景

 

重度酒精相关性肝炎（SAH）与肝脏和多器官功能衰竭相关，并且增加肝移植的需求以及增加死亡率。SAH的发病机制涉及多种分子机制，包括microRNA（miR）的失调。我们的假设是，患有SAH的患者表现出循环外泌体miRNA（CE-miRs）的失调。为了验证这一假设，我们比较了SAH患者与健康对照组（HC）中肝miRNA（H-miRs）和CE-miRs的表达谱和功能。

 

研究方法

 

我们提取了血清外泌体并从外泌体和肝组织中分离了总RNA。使用PartekFlow分析CE-miRs，使用NanoString nCounter分析H-miRs。使用TargetScan和mirnet v2.0鉴定潜在的靶基因。使用STRING数据库构建蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用Cytoscape软件可视化枢纽基因。

 

研究结果

 

我们的研究miR-seq数据分析揭示了差异表达的CE-miRs（DE-CE-miRs）。而与HC相比，SAH肝组织数据同样显示了差异表达的H-miRs（DE-H-miRs）。有趣的是，在上调的DE-H-miRs中，有部分CE-miRs在SAH患者中也上调。进行GO和KEGG分析以预测这些DE-miRs的靶基因，通过PPI网络分析确定了枢纽基因。使用GSE数据集，我们发现在鉴定的枢纽基因中的12个在SAH患者中明显下调与HC相比。这些下调的基因代表了上调的9个CE-miRs的潜在靶标。此外，这些DE-miRs与多种与癌症相关的信号通路相关，包括凋亡、应激反应和血管生成。

 

研究结论

 

在肝脏和循环外泌体中发现的DE-miRs与重度酒精相关性肝炎（SAH）相关。这些发现表明它们具有作为潜在的诊断和预后标志的可能性，同时也可能是未来研究SAH的治疗靶点。

 

 

研究四

NAT10及其介导的mRNA ac4C修饰参与母代高脂饮食的子代NAFLD

 

4629-C: NAT10-mediated N4-acetylcytidine of hepatic lipogenesis-associated mRNA contributes to maternal high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease in juvenile offspring

 

第一作者：张骞仁；通讯作者：范建高

 

▲AASLD2023壁报展示（4629-C）

 

研究背景

 

越来越多的证据表明，早期暴露于妊娠和哺乳期母代高脂饮食（HFD）增加了幼年后代患非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的风险。表观遗传修饰是指在不改变DNA序列的情况下使基因功能发生改变的修饰，已被广泛认为是母代异常营养状态诱导子代发生包括NAFLD在内诸多代谢性疾病的关键机制。作为一种新型的转录水平上的表观修饰，N-乙酰转移酶-10（NAT10）介导的N4-乙酰化（ac4C）修饰可以通过增加mRNA的稳定性和翻译效率来增强靶基因的表达。

 

研究目的

 

本研究的目的是探讨NAT10及其介导的mRNA ac4C修饰在母代HFD诱导子代NAFLD中的作用。

 

研究方法

 

6周龄野生型（WT）雌性C57BL/6J小鼠在受孕前6周以Chow或HFD饮食喂养，并在妊娠和哺乳期间继续保持相同的饮食。将Nat10 fl/fl小鼠与Albumin（Alb）-Cre小鼠合笼，得到肝细胞特异性Nat10敲除（Nat10 HKO）小鼠。将以Chow喂养的雄性Nat10 HKO小鼠与饲喂Chow或HFD的雌性Nat10 fl/fl小鼠合笼，将出生的子鼠进一步分为4组：Nat10 fl/fl + Chow组、Nat10 HKO+Chow组、Nat10 fl/fl+HFD组和Nat10 HKO + HFD组。检测3周龄雄性子鼠体重、肝脏组织病理特征和肝脏及血清中的脂质含量。此外，对子鼠肝脏进行了脂质代谢相关基因（Srebp1c、Acc、Fasn、Ppara、Cd36和Fatp2）蛋白和mRNA表达的检测。在体外，通过转染NAT10小干扰RNA（si-NAT10）或过表达质粒来敲减或增加HepG2细胞中NAT10表达水平。通过油红O染色和甘油三酯（TG）检测评估细胞内脂质沉积。用BODIPY FL C16染料处理敲低或过表达NAT10的HepG2细胞，以检测脂质摄取。使用放线菌素D（ActD）评估靶mRNA的稳定性，并通过RNA免疫沉淀实验确定NAT10蛋白与靶mRNA之间是否存在直接结合。

 

研究结果

 

来自HFD喂养母鼠的WT子鼠在断乳时体重、肝脏TG水平较高，组织病理显示肝脏脂质蓄积增加，并且NAT10 mRNA和蛋白表达水平显著上调，肝脏RNA总ac4C修饰水平增加。Nat10 fl/fl + HFD组子鼠肝脏比Nat10 fl/fl + Chow组发生更严重的脂质蓄积。然而，Nat10 HKO + HFD组子鼠的肝脂肪变性程度较Nat10 fl/fl+HFD组子鼠显著改善。

 

与Nat10 fl/fl+HFD组子鼠肝脏相比，Nat10 HKO+HFD组子鼠脂质生成相关基因的mRNA（Srebp1c和Fasn）和蛋白（SREBP-1c、磷酸化ACC和FASN）表达水平显著下调。同时，作为脂质β-氧化的关键正调节因子，Pparα的mRNA和蛋白表达水平在Nat10 fl/fl + HFD组子鼠肝脏中显著上调。母代HFD显著提高了3周龄后代肝脏中脂质摄取相关基因（Cd36和Fatp2）的表达水平。通过小鼠腹腔注射BODIPY FL C16实验发现，与Nat10 fl/fl小鼠相比，Nat10 HKO小鼠的肝脏中BODIPY FL C16荧光的强度显著降低，表明其肝脏脂质摄取量降低。

 

在体外，使用siRNA敲低NAT10表达显著改善了PA诱导的HepG2细胞中脂质蓄积。此外，NAT10敲低细胞BODIPY FL C16的摄取显著减少，同时CD36和FATP2表达下调，这与体内实验观察到的结果相似。在HepG2细胞中过表达NAT10能够诱导其发生脂质蓄积，对BODIPY FL C12的摄取和CD36、FATP2表达也显著增加。

 

使用ActD抑制NAT10敲低或过表达的HepG2细胞转录。结果显示，在NAT10敲低细胞中，CD36和FATP2 mRNA的稳定性降低，而在NAT10过表达细胞中，它们的稳定性增加。进一步通过RIP实验发现，NAT10蛋白可以直接结合CD36和FATP2的mRNA，并且过表达NAT10后，与NAT10结合的CD36、 FATP2 mRNA丰度显著增加。

 

研究结论

 

NAT10在母代HFD诱导后代NAFLD中发挥了重要作用，可能是NAFLD的潜在治疗靶标。

 

研究五

Sestrin2通过抑制RIPK3介导的坏死性凋亡在非酒精性脂肪肝炎中发挥维持肝免疫稳态和氧化还原平衡的作用

 

2367-C: Sestrin2 maintains hepatic immune homeostasis and redox balance by inhibiting RIPK3-mediated necroptosis in non-alcoholic steatohepatitis

 

第一作者：张建斌；通讯作者：范建高

 

▲AASLD2023壁报展示（2367-C）

 

研究背景

 

坏死性凋亡是一种与炎症反应密切相关的新型程序性细胞死亡形式。目前，大多数研究集中在坏死性凋亡的激活上，对坏死性凋亡的负调控机制的了解仍然有限。在这里，我们的研究旨在探讨应激诱导蛋白Sestrin2（SESN2）在非酒精性脂肪性肝炎中对坏死性凋亡的调控功能和分子机制。

 

研究方法

 

通过在TNFα/Smac-mimetic/Z-VAD-FMK（T/S/Z）诱导的细胞坏死性凋亡模型中评估SESN2敲除对坏死性凋亡调控的影响。使用Western blot、免疫共沉淀、GST pull-down和共聚焦显微镜分析等方法探索蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰（如磷酸化和泛素化）等调控机制。此外，我们使用GSK'872，一种特异性的RIPK3抑制剂，来确定SESN2敲除细胞/小鼠中的表型是否与RIPK3介导的坏死性凋亡引起的，该模型包括棕榈酸（PA）诱导的体外模型和高脂高胆固醇饮食（HFHCD）诱导的体内模型。

 

研究结果

 

我们发现，在诱导坏死性凋亡的条件下，SESN2的表达上调并作为坏死性凋亡的负调控因子发挥作用。在机制上，我们发现SESN2与RIPK3相互作用，SESN2可以通过抑制RIPK3的磷酸化、促进RIPK3的泛素化降解以及减少RIPK1/RIPK3坏死体的形成等方式，调控坏死性凋亡。SESN2的缺失会导致过度激活的坏死性凋亡，伴随着实验性脂肪性肝炎模型中脂肪积累、炎症和氧化应激的增加。通过RIPK3抑制剂GSK’872阻断坏死性凋亡可防止炎症因子的释放和ROS生成，但对于SESN2-KO细胞和HFHCD饲养的SESN2-KO小鼠中的肝细胞脂肪沉积无显著作用，证明了由SESN2基因敲除引起的过度炎症和氧化应激至少部分是由RIPK3介导的坏死性凋亡引起的。

 

研究结论

 

总体而言，我们的研究结果表明SESN2通过抑制RIPK3介导的坏死性凋亡来调节肝脏的免疫稳态和氧化还原平衡，这一调控对于维持肝脏健康至关重要。

 

范建高教授和曾静医师在AASLD现场

 

 

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