编者按

在2024年美国肝病研究学会（AASLD）年会上，温州医科大学附属一院卢明芹教授团队展示了其最新的研究成果——利用内毒素耐受树突状细胞来源的仿生外泌体负载铱纳米酶（ETDC-EM/Ir NPs-PVP）治疗急性肝衰竭。该研究通过构建ETDC来源的外泌体模拟物，并负载具有过氧化氢酶和过氧化物酶样活性的铱纳米酶，显著提升了治疗效率。在小鼠急性肝衰竭模型中，ETDC-EM/Ir NPs-PVP展现出了良好的抗炎和抗氧化作用，有效减轻了肝脏病理损伤，延长了小鼠生存时间。这一创新疗法为急性肝衰竭的临床治疗提供了新的思路，有望为改善患者预后带来重大突破。

 

AASLD 2024壁报展示（No.4042）

 

研究背景和目的

 

急性肝衰竭（ALF）是短期内肝功能迅速恶化伴随全身多器官功能衰竭的一组临床综合征。发病过程伴随着氧化应激、线粒体功能紊乱等，其病因多样，发病机制复杂，目前缺乏令人满意的治疗方法。作为先天性免疫和适应性免疫之间桥梁的树突状细胞（DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞（APC）。内毒素耐受（ET）被定义为首次接受小剂量脂多糖（LPS）刺激后对后续大剂量或致死剂量的LPS刺激表现为反应性降低的现象。我们以往的研究发现内毒素耐受的树突状细胞（ETDC）具有良好的抗炎作用。然而直接输注ETDC治疗在活体内的稳定性较差，因此我们设计了内毒素耐受树突状细胞来源的外泌体模拟物（ETDC-EM），与传统的外泌体（Exo）相比，外泌体模拟物（EMs）的产率大大提高，获得过程更加简单便捷。聚乙烯吡咯烷酮稳定的铱纳米颗粒（Ir NPs-PVP）是首次被报道为具有内在过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）样活性的多酶模拟物，研究表明其在细胞水平能够有效的清除活性氧（ROS）。

本研究构建了ETDC来源的EMs，同时在ETDC-EM的抗炎基础上负载Ir NPs-PVP进行抗氧化作用，通过尾静脉将 ETDC-EM/Ir NPs-PVP 注入ALF小鼠体内探讨ETDC-EM/Ir NPs-PVP在急性肝衰竭中的治疗作用,，此研究能够为急性肝衰竭的临床治疗提供一种新的思路。

 

研究方法

 

从小鼠体内提取骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），在第5天用100 ng/mL的脂多糖（LPS）刺激，第7天用1 μg/mL的LPS刺激，将BMDCs转化为内毒素耐受性树突状细胞（ETDCs）。采用乙醇热还原法制备了分散性良好的铱纳米粒子酶（Ir NPs-PVP），并对其进行了表征。通过尾静脉注射将ETDC-EM/Ir NPs-PVP注入健康雄性小鼠体内，随后通过腹腔注射D-氨基半乳糖（D-GaIN）和LPS，以建立小鼠急性肝衰竭模型。之后观察其对肝脏的影响。

 

研究结果

 

流式细胞仪结果显示经过GM-CSF和IL-4诱导分化后的小鼠骨髓来源的树突状细胞纯度为75.7%。光学显微镜结果显示经过两次LPS刺激后得到的ETDC与没有经过LPS刺激的BMDC形态相似，而仅仅经过一次大剂量LPS刺激的mDC表面突起更多。

 

在经过乙醇热还原法反应后最终得到的黑色粉末为Ir NPs-PVP。TEM图像显示Ir NPs-PVP为亚球形结构。通过纳米测量仪根据TEM图像测量铱纳米酶颗粒的平均直径为1.749±0.08 nm，纳米粒度仪测量Ir NPs-PVP的zeta电位为-15.4 mV。Ir NPs-PVP的XPS谱证实了Ir的化合物状态。

 

TEM图像显示ETDC-EM和ETDC-EM/Ir NPs-PVP均为具有完整膜结构的球形，且呈现出均一的大小，但与ETDC-EM相比，含有Ir NPs-PVP的ETDC-EM内部显示出黑色小颗粒。纳米粒度仪测量ETDC-EM和ETDC-EM/Ir NPs-PVP的平均粒径及zeta电位分别为84.85 nm和86.6 nm及11.77 mV和22.8 mV。紫外分光光度计显示了Ir NPs-PVP，ETDC-EM和ETDC-EM/Ir NPs-PVP的紫外吸收光光谱，在280 nm处ETDC-EM具有特殊的紫外吸收峰，而ETDC-EM/Ir NPs-PVP在250 nm左右出现一个新的波谷。

 

随着Ir NPs-PVP浓度的增加，H2O2被清除的越多，当Ir NPs-PVP 的浓度为200 μg/mL时H2O2清除率为80%，200 μg/mL的Ir NPs-PVP对不同浓度H2O2的清除率约为99%，具有良好的类CAT活性，且当H2O2适当增加时，Ir NPs-PVP的CAT活性也相应提高。同时，在相同的H2O2浓度下，当Ir NPs-PVP的浓度为200 μg/mL时POD样活性为61.22 u/mL，而在H2O2为10 mM时，200 μg/mL的Ir NPs-PVP的POD样活性为147.4 u/mL。流式细胞术也验证了Ir NPs-PVP能够有效地清除细胞内ROS。ESR上•OH自由基特征峰的消失表明IrNP-PVP可以有效清除•OH。

 

ELISA数据显示，加入ETDC-EM后经大剂量LPS刺激的RAW264.7细胞上清中炎症细胞因子TNF-ɑ和IL-1β的分泌明显减少。加入ETDC-EM后经大剂量LPS刺激的RAW264.7细胞CD86的阳性表达率从80.9%降为33.1%（P＜0.05）。

 

ICP-MS表明，当ETDC为2×106个细胞时，能够将2 mg/mL的Ir NPs-PVP包裹200 ug，其装载率为10%。通过ICP-MS看出，0.5 h-6 h内Ir NPs-PVP在小鼠肝脏内代谢较快，而ETDC-EM/Ir NPs-PVP在小鼠肝脏内的代谢较为平缓。多模式光学活体成像系统拍摄到ETDC-EM和ETDC-EM/Ir NPs-PVP均在小鼠肝脏内聚集，且载有Ir NPs-PVP的ETDC-EM更快聚集到肝脏。

 

图1：（a）ETDC-EM中Ir NPs-PVP含量检测。（b）ETDC-EM/Ir NPs-PVP中Ir NPs-PVP代谢检测。（c）ETDC-EM/Ir NPs-PVP的紫外可见光谱。（d）通过体内成像系统捕获的小鼠肝脏荧光图像。（e）体内成像定量结果

 

紫外分光光度计显示出ETDC-EM/Ir NPs -PVP中Ir NPs-PVP的释放量与时间成正比。

 

通过Ir NPs-PVP，ETDC-EM，ETDC-EM/Ir NPs-PVP组小鼠的重要脏器HE染色看出，上述各治疗药物对小鼠心、肝、脾、肺、肾均没有显著的损害。CCK8结果也表明这些治疗药物在72 h内对RAW264.7细胞没有明显的细胞毒性。利用荧光显微镜看出通过Calcein-AM/PI染色后的RAW264.7细胞大多呈现绿色荧光。溶血试验也验证了当ETDC-EM/Ir NPs-PVP达到最高治疗浓度时溶血率为1.42%。

 

在急性肝衰竭小鼠模型中评估了ETDC-EM/Ir NPs-PVP的治疗效果。

 

图2：（a）健康组、急性肝衰竭组、Ir NPs-PVP组、ETDC-EM组和ETDC-EM/Ir NPs-PVP组小鼠肝组织的HE染色。（b）肝组织中IL-1β的免疫组化染色。（c）肝组织中TNF-α的免疫组化染色。（d）TNF-α免疫组化染色的定量。（e）IL-1β免疫组化染色的定量。（f）小鼠血清中TNF-α的表达水平。（g）小鼠血清中IL-1β的表达水平。（h）小鼠血清中ALT水平。（i）小鼠血清中AST水平。

 

HE结果显示在经过ETDC-EM/Ir NPs-PVP治疗后的小鼠肝脏病理改变显著减轻。IHC结果也表明ETDC-EM/Ir NPs-PVP能够减轻小鼠肝脏炎症导致的病理损伤，肉眼观察到治疗组小鼠肝脏充血减轻。治疗组血液中炎症细胞因子水平以及血清中ALT和AST也显著下降 （P＜0.05）。小鼠的生存曲线结果显示ETDC-EM/Ir NPs-PVP能够有效地延长ALF小鼠的生存时间。

 

使用二氢乙锭（Dihydroethidium，DHE）对小鼠肝脏组织进行染色以评估肝脏组织中的ROS水平。经ETDC-EM/Ir NPs-PVP处理后，ROS的DHE红色荧光显著减弱，ALF小鼠肝脏中ROS水平显著受到抑制，表明IrNP-PVP在ALF治疗中具有良好的抗氧化保护能力。

 

研究结论

 

在这项研究中，我们证实了Ir NPs-PVP具有良好的抗氧化作用而ETDC-EM在体内外具有抗炎作用，经过推挤法获得的ETDC-EM/Ir NPs-PVP在小鼠体内具有良好的抗炎抗氧化作用，在一定程度上能够缓解急性肝衰竭小鼠肝脏的炎症反应，对肝脏起到保护作用。

 

专家简介

 

卢明芹 教授

温州医科大学附属一院

温州医科大学附属一院感染科主任 主任医师 教授

中国医师协会感染科医师分会委员

中国研究型医院学会肝病专业委员会常委

浙江省医学会细菌感染与耐药防治分会副主任委员

浙江省医学会热带病与寄生虫病分会副主任委员

浙江省中西医结合学会感染病分会副主任委员

温州市医学会细菌感染与耐药防治分会主任委员

温州市医学会感染病、肝病分会候任主任委员

 

（来源：《国际肝病》编辑部）

 

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