编者按：在慢性乙肝病毒（HBV）感染的机制研究与抗病毒药物开发中，动物模型的临床相关性始终是制约转化医学的关键瓶颈。2025年11月7日-11日，第76届美国肝病研究学会（AASLD）年会在美国 • 华盛顿会议中心召开。在本届大会上，维通达尹明博士、苗振川博士研发团队通过两项创新研究，分别从人源化肝脏小鼠模型优化与多基因型HBV载体模型构建角度突破技术壁垒，其成果入选国际肝病研究顶会AASLD 2025壁报展示，为肝病研究提供了更精准的工具支撑。

研究一：优化制备方案提高人源化肝脏小鼠人肝细胞嵌合率，该模型可支持HBV高效感染并复刻人肝脏特征

（大会壁报号：1359）

研究背景及目的

人源化肝脏小鼠模型在研究人肝细胞特有的功能、肝病及其治疗上具有重要应用价值。URG®小鼠为Rag2和Il2rg基因敲除的高度免疫缺陷小鼠，并转入了TetOn调控表达的uPA基因，当用Dox诱导时在肝脏特异性过表达uPA基因，引起小鼠肝损伤，可以接受外源肝细胞包括人肝细胞的移植。移植原代人肝细胞的URG®小鼠称为Hu-URG。虽然URG®小鼠具有易于繁殖，健康状态好，维持成本低等优势，但在早期的应用中发现模型中极少有人源肝细胞替换率超过50%，血清人白蛋白含量超过6mg/mL的，且尽管持续给与Dox诱导，人肝细胞嵌合仅能维持4个月。本研究通过优化Hu-URG制作方法，使人肝细胞替换率显著提高，并可支持HBV的高感染。

本文报道，优化Hu-URG小鼠的制备方案后，其嵌合率得到显著提升——该高嵌合率可支持乙肝病毒（HBV）的高效感染、药物代谢研究、人源化肝靶向基因药物筛选，以及辅助药物（如腺相关病毒AAV）的肝靶向递送系统研发。

研究方法

改变URG®小鼠移植人肝细胞之后Dox诱导方案，由固定浓度的Dox饮水，改变为从起始的0.1 mg/mL逐渐升高到5周后的0.5 mg/mLDox，造成持续的慢性肝损伤，从而延长外源肝细胞增殖时间窗口。将URG®小鼠的饲料在移植手术后由繁殖饲料改为粗脂肪含量低于4%的低脂料。检测血清人白蛋白含量确定人肝细胞的植入，用人肝特异性抗体免疫组化染色确定人肝细胞替换率。在原代人肝细胞（PHH）移植后约10周时，收集5只Hu-URG小鼠（HSA含量为6-10 mg/mL）的肝脏组织进行RNA测序（RNA-seq）分析，并以原代人肝细胞（PHH）作为对照。将测序数据与人类肝细胞数据库进行比对，评估药物代谢酶、脂质代谢、糖代谢及凝血因子相关基因的表达谱。随后，向Hu-URG小鼠（每组5只，HSA含量为6-10 mg/mL）接种不同来源和亚型的HBV毒株，比较其维持病毒学指标的难易程度。

研究结果

未更换为低脂饲料的Hu-URG小鼠中，肝脏病理切片显示人肝细胞通常会大量蓄积脂肪，且在移植8周后发生脂肪变性，优化后，低脂饲料显著减少了肝脏组织切片中的脂滴（图 1H），与优化前的人血清白蛋白（HSA）水平相比，优化方法后Hu-URG血清白蛋白含量显著提升，且稳定期可达一年。血清HSA含量最高可达15mg/mL。（图 1A-D）。免疫组织化学（IHC）染色分析显示，肝脏组织切片中人白蛋白、细胞色素CYP1A2、细胞色素CYP3A4等标志物的阳性染色区域占比最高可达95%，且在肝脏各叶均匀分布（图 1E-G）。

图1. 优化Hu-URG小鼠HSA的连续监测，以及肝脏组织的IHC和H&E染色结果

Hu-URG小鼠易感染A、B、C亚型HBV，但仅A亚型能维持相对长期的稳定期（高病毒载量）（图 2A-I）。在肝脏组织中可检测到HBcAg、HBsAg及乙肝共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）（数据未展示）。RNA测序（RNA-seq）结果显示，Hu-URG小鼠肝脏中与人源药物代谢酶、糖代谢、脂质代谢及凝血因子相关的基因，在基因种类和表达水平上均与原代人肝细胞（PHH）高度相似（图 2J-L）。

图2. 感染不同HBV亚型的Hu-URG小鼠，以及Hu-URG小鼠肝脏组织与PHH和人肝细胞数据库的RNA-seq分析

研究结论

长期慢性肝损伤有利于移植的外源肝细胞的增殖、替换，在URGG®小鼠上可以通过调节诱导的Dox剂量来很好地实现。嵌合肝脏中的人肝细胞倾向于积累脂质，引起脂肪变性，影响人肝细胞的增殖并在后期引起人肝细胞的丢失、嵌合率的下降。使用低脂饲料可以改善人源肝细胞的脂肪化，提高嵌合率和稳定期。优化后的Hu-URG小鼠支持各种基因型的HBV的长期稳定感染，为HBV生物学研究以及抗乙肝药物评价提供了理想的体内模型。此外，高嵌合率的Hu-URG小鼠还适用于药物代谢研究、人源化肝靶向基因药物筛选，以及辅助药物的肝靶向递送系统研发。

研究二：AAV介导的不同基因型HBV携带小鼠模型的特点研究

（大会壁报号：1363）

研究背景及目的

功能性治愈（又称临床治愈）是目前国内外慢性乙型肝炎（CHB）防治指南公认的理想治疗目标，为实现这一目标，制定个性化治疗方案尤为重要。HBV至少包含8种基因型及更多变异株，其在不同遗传背景的感染者中引发的症状存在差异。为研发新型有效药物并实现该疾病的个体化治疗，亟需建立具有临床相关性的HBV感染动物模型。通过注射携带完整HBV基因组的重组腺相关病毒（rAAV）载体制备的AAV-HBV小鼠模型，能良好模拟HBV携带状态，且适用于体内抗HBV药物评价。据既往研究表明，构建AAV-HBV模型时，尤其是针对B基因型，很难维持长期稳定的病毒学指标。

本研究旨在比较不同基因型的HBV基因组序列构建的AAV-HBV不同剂量注射小鼠建立的模型的病毒学指标、肝损伤和免疫耐受特征（尤其是B型病毒），以匹配不同的疗效人群，探讨模型对乙肝研究的启示和在新疗法研发中的选择及应用。

研究方法

用不同剂量的B、C、D型AAV-HBV注射C57BL/6和免疫缺陷小鼠(NPG小鼠），检测小鼠外周血中的HBV DNA、HBsAg、HBeAg，以及各型AAV-HBV建立的小鼠模型病毒血症指标的水平与注射剂量呈剂量相关性。

研究结果

每种AAV-HBV载体所建立的小鼠模型，其病毒血症指标水平均呈剂量依赖性。D基因型AAV-HBV即使注射剂量低至1×10⁸vg/只，也能建立稳定的HBV携带状态（图3A、图4A-B）；而C基因型AAV-HBV仅在注射剂量超过2×10⁹vg/只时，才能在免疫正常小鼠中维持HBV病毒血症（图3B、图4C-D）。低剂量C基因型AAV-HBV载体在小鼠中仅能维持数周病毒血症，而在免疫缺陷小鼠中，HBV病毒血症可保持稳定（图5）。研究发现，即使注射剂量高达1×10¹¹ vg/只，B基因型AAV-HBV在免疫正常小鼠中也难以建立稳定的HBV感染状态，除非使用B基因型HBV突变体序列（图3C、图4E-F）。有趣的是，向高度免疫缺陷NPG小鼠注射1×10¹¹ vg的B/C/D亚型AAV-HBV载体后，B、D基因型易维持稳定的病毒学指标，而C基因型相对难以维持（图5）。

图3. 不同基因型AAV-HBV载体（C57小鼠）不同注射剂量下的血清HBsAg水平

图4. 不同基因型AAV-HBV载体（C57小鼠）不同注射剂量下的血清HBV DNA与HBeAg水平

图5. 不同基因型AAV-HBV载体（NPG小鼠）不同注射剂量下的血清HBV DNA、HBsAg及HBeAg水平

研究结论

各基因型HBV序列建立AAV-HBV小鼠模型的效率不同，值得注意的是，我们已筛选出能稳定表达B基因型HBV的AAV-HBV载体，为抗B型HBV药物研究提供了理想的病毒复制模型。HBV病毒血症的水平与各型病毒的复制效率有关，但与HBV抗原诱导免疫耐受的能力关系更大，HBV病毒学指标下降是因为发生了免疫清除。各型HBV诱导免疫耐受的能力D>C>B。结果提示HBV抗原的多态性与乙型肝炎个体的不同临床病理特点相关。

（来源：《国际肝病》编辑部）

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