国际肝病 发表时间：2025/5/9 11:21:47
作者：桂林市第三人民医院主任医师 程书权
目前认为，HBV进入人体后在肝细胞核内形成稳定的共价闭合环状DNA（cccDNA），是HBV难以清除和发生慢性化的主要原因。迄今，纳入我国指南的一线抗HBV治疗药物核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素（IFN）两类，均难以彻底清除cccDNA。因此，彻底实现慢性乙型肝炎（CHB）的完全治愈前路漫漫。
当下评价CHB治疗效果的理想终点依然仅为HBsAg、HBeAg和HBV DNA的持续消失，但上述三项指标均难以全面反映肝内的cccDNA是否已被完全清除，亦无法更好地预测停药后的复发，导致大多数CHB患者可能需要被迫长期甚至终身服药。
由于cccDNA潜伏于肝细胞核内，因此只能通过肝穿刺活检等有创技术进行检测。临床迫切需要能反映cccDNA活性的血清标志物。近年的诸多研究表明，血清HBsAg水平与肝脏cccDNA的相关性优于HBV DNA水平，这表明它可能是cccDNA的间接标记物。但深入研究发现，此种相关性在HBeAg阳性患者中满意，而在HBeAg阴性患者中则大为逊色，因HBsAg还可从转录自cccDNA或整合HBV DNA的亚病毒RNA翻译。基于HBsAg主要来源于HBeAg阳性患者的cccDNA，而HBeAg阴性人群中增加的部分主要衍生自整合HBV DNA。已有的研究提示，血清HBV RNA水平可能是比HBsAg水平更可靠的反映肝脏cccDNA的替代指标。
现有的检测方法已很好地解决了HBV感染临床诊断的问题，但在普遍抗HBV治疗的状况下，依然缺乏良好的判断临床疗效的敏感指标，尤其是经NAs治疗后HBV DNA检测不到的情况下，如何进一步判断疗效及预后、可否治愈等停药，成为对检验医学提出的新需求。
早在1996年，德国学者首次发现，除HBV DNA外，在感染HBV者的血清中存在着HBV RNA。HBV侵入肝细胞后，rcDNA在细胞核内以负链DNA为模板，延长正链以修补裂隙形成cccDNA。HBV以cccDNA为模板，转录成几种不同长度的mRNA。其中，超基因组全长度的3.5 kb大小的前基因组RNA（pgRNA）只能转录自cccDNA，故其水平可以反映肝组织内cccDNA的状态。HBV RNA是包含pgRNA和其剪切变异体的病毒样颗粒或衣壳抗体复合物，pgRNA是cccDNA直接转录产物，可以反映cccDNA转录活性，而它作为逆转录模板，是唯一可在外周血清中被检测出来的项目。
虽然HBV DNA和HBsAg与肝内cccDNA水平呈正相关，但其消失仅能反映HBV在逆转录过程中受抑制，不能体现cccDNA转录活性，即使长期抗HBV治疗后，患者的cccDNA几近耗竭或沉默，但因HBV DNA片段的整合，HBsAg指标可能仍可为阳性。但在HBeAg阳性的CHB，血清HBV RNA的水平则与cccDNA呈正相关，而当HBeAg转阴后，虽二者的相关性消失，但HBV RNA仍可定性反映cccDNA的转录活性。新近研究通过qRT-PCR与RT-PCR技术检测发现，NAs治疗后随着HBV DNA的下降，而HBV RNA却呈上升趋势，且其上升程度大致与HBV DNA的下降量一致。HBV RNA在指导NAs安全停药方面具有特殊意义。
绝大多数循环的HBV病毒颗粒含有部分双链的松弛环状DNA，然而，已有报道含有HBV RNA的循环“病毒颗粒”。这些包含RNA的病毒颗粒在接受NAs治疗的患者中更丰富，可能是由于NAs抑制pgRNA的逆转录导致衣壳pgRNA的积累，其中一些可能被包围和分泌。因此，在接受NAs治疗者中，在血清HBV DNA已检测不到时，检测HBV RNA可间接用以推测正在进行的cccDNA转录，且已被证明是停止NAs治疗后病毒复发的预测因子。
血清HBV RNA的测定迄今被视为了解cccDNA转录活性的重要替代物。国内有研究已确定，血中HBV RNA实际是由未经转录或转录不完全的pgRNA经衣壳化，被HBsAg包裹所形成的病毒样颗粒。血清中除了全长HBV pgRNA外，还产生了大量3’端截短型的pgRNA及不同类型的pgRNA剪接异质体，但哪种pgRNA在血清中占有主导地位，仍需要RNA测量技术的进一步发展来证实。pgRNA由肝内cccDNA直接转录而来，因此血清HBV RNA能一定程度上反映肝内cccDNA活性。
近年北京大学基础医学院团队的研究，揭示血清中的HBV RNA实质是存在于核衣壳内未完成或部分完成逆转录的pgRNA，作为肝内cccDNA的直接下游转录产物，HBV RNA可有效反映肝内cccDNA的转录活性。在国家传染病防治科技重大专项“十三五”系列中，将创新指标血清HBV RNA成功进行了转化，并于2022年获得国家药监局批准的第一个基于荧光定量PCR技术的HBV RNA诊断试剂注册证。
当前HBV RNA的常用检测技术有直接定量（SAT）和间接定量（RT-PCR）两种。相较而言，前者具有更高的检测灵敏度及准确性。复旦大学已发表的研究也证明，血清HBV RNA水平能反映肝内cccDNA的转录活性，可以作为CHB评估疾病进展的非侵入性生物标志物，被认为是cccDNA的理想替代指标。
未进行NAs抗病毒的CHB，血清中pgRNA水平与病毒载量相关，无论感染持续抑或消退，血清pgRNA浓度均低于HBV DNA，并始终保持在约两个对数。在NAs治疗后，HBV DNA与pgRNA水平关联性低，先于pgRNA检测不到，随后才出现pgRNA下降，当HBV DNA和pgRNA均检测不到时，代表了cccDNA数量减少或静默。
据国内对25例HBeAg阳性和22例HBeAg阴性的CHB者，NAs治疗至少1年且HBV DNA持续阴转的研究发现，血中HBV RNA与肝组织内HBV RNA水平、肝内病毒转录活性（肝内HBV RNA/cccDNA）正相关，并认为血HBV RNA能反映肝内HBV DNA数量和cccDNA转录活性。
另一项对84例未接受抗HBV治疗者进行的研究发现，其中64例HBeAg阳性者HBV RNA、HBV DNA、HBV DNA+RNA与肝内cccDNA均有相关性。认为血清总HBV核酸(HBV DNA+RNA)在反映肝内cccDNA活性方面有优势，单此种相关性仅在HBeAg阳性的CHB阶段出现。
国内还有54例长期接受NsA治疗的HBeAg阳性CHB患者研究，定期采集连续血清样本，定量分析HBsAg、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg，并间隔5年进行2次肝穿刺。经多因素分析显示，治疗前与肝内cccDNA相关性依次为：HBV DNA+RNA、HBV DNA、HBV RNA和HBcrAg；NAs治疗5年后与cccDNA下降的相关性分别为：HBV DNA+RNA、HBV RNA、HBV DNA和HBsAg，可见HBV DNA+RNA变化与cccDNA下降的相关性更好，且只有HBV DNA+RNA下降与cccDNA下降呈正相关。认为HBeAg阳性的CHB患者NAs治疗前及治疗中血清HBV DNA+RNA与肝内cccDNA的相关性优于其他病毒标志物。
多个研究证实，当患者因接受NAs药物治疗使病毒DNA的逆转录合成受到抑制时，血清HBV RNA水平依旧能反映肝组织中cccDNA的状态。血清HBV RNA来自pgRNA，能反映cccDNA的存在以及转录活性。因此，通过检测HBV RNA，具有以下临床应用价值。
（1）预测CHB患者接受NAs或PEG-IFN的治疗应答：患者接受NAs治疗停药时HBV RNA高水平者，停药复发风险升高，PegIFN治疗后HBV RNA低值或阴性者，HBsAg的下降速率和发生抗-HBs血清学转换的概率亦高。因此，在CHB者抗HBV治疗过程中，监测HBV RNA水平，能真实反映cccDNA的转录活性状态，对优化CHB患者的治疗策略以及辅助临床停药标准的判定有重要意义，尤其是经治后HBV DNA阴转者，可用持续监测HBV RNA水平的方法，作为肝内HBV存殁消长的间接指标。
据加拿大一项纳入133例HBeAg阴性的CHB研究，经PegIFN治疗48周，发现12周HBV RNA水平在应答组较非应答组低，12周HBV RNA水平较低者，144周获得HBsAg(＜100 U/mL)和HBsAg阴转比率较高，HBV RNA早期下降可预测HBeAg阴性CHB患者病毒学应答。
国外另一项研究也表明，对初治HBeAg阳性者，基线时HBV RNA＞2×105拷贝/mL，干扰素治疗12周后，若仍在HBV RNA＞3000拷贝/mL，则在24周时很难实现血清学转换。
还有一项研究纳入的92例CHB者，予干扰素联合NAs治疗72周，若HBeAg阳性者在用药30周时，HBV RNA水平下降≥3.82 log10拷贝/mL，在72周更易达到病毒学应答，HBeAg阴性者，联合治疗6周时HBV RNA水平低于检测下限时则更易在72周时达到病毒学应答。
欧洲一项研究对HBeAg阳性患者，应用以干扰素为基础的抗病毒治疗后的12、24周，HBV RNA水平均较前下降明显，相比HBsAg、HBV DNA指标，HBV RNA水平的下降能更好地预测HBeAg血清学转换。
一组通过对CHB患者经治的研究也表明，在治疗96周时，HBV DNA下降幅度较HBV RNA更显著[（5.45±1.49）log10 U/mL vs.（2.82±1.47）log10 U/mL]。故对长期治疗者，HBV RNA能更好预测病毒学应答；对于HBeAg血清学转换，HBV RNA在96周的低水平则有更好的预测价值。
国内一项多中心、随机、对照试验，纳入855例PegIFN治疗者的多因素分析发现[10]，第0、12、24和48周的HBV RNA和其他因素（HBV DNA、ALT、HBsAg、HBeAg、HB基因型、年龄、体重）均为HBeAg血清学转换的独立预测因素，其中基HBV RNA≤6.0log 10 IU/mL者的阳性预测值为61.65%，可预测PegIFN治疗后的HBeAg血清学转换；第12周HBV RNA＞5.2 log10 IU/mL者的阴性预测值为95.6%。
另外一项中位随访时间为108个月的研究还表明，在基线、治疗后6个月和12个月较低的血清HBV RNA水平可以预测长期（36、60、84个月）HBeAg清除率和血清转换率，效果优于HBcrAg、HBV DNA和HBsAg。CHB者在基线时HBV RNA＜4.12 log10拷贝/mL，更容易实现HBeAg血清学转换。若NAs治疗后48周，HBV RNA仍然阳性，则HBeAg清除失败风险颇高。对HBeAg阴性者，HBsAg＜100 U/mL且血清HBV RNA水平较低或检测不到者，表明其肝内cccDNA转录活性低，为实现功能性治愈的优势人群。通过与HBsAg的比对还发现，CHB应用干扰素治疗24周时HBV RNA有良好应答者，HBsAg转阴率较高，但若HBsAg无明显下降或处于较低水平的平台期不易转阴，则单纯HBV RNA应答预测HBsAg转阴的作用有限。
（2）预测接受NAs或PegIFN治疗停药后的复发风险：近年HBV RNA用于停药复发风险的预测，已被纳入多个指南或共识，包括我国《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》、2017年EASL《乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南》、中华医学会肝病学分会发表的《慢性HBV感染者血清HBV NA检测及临床应用专家共识（2022）》等。
国内一项对127例HBeAg阳性CHB患者进行NAs治疗后停药随访的研究显示，停药4年后，HBV DNA及RNA在停药时均为阴性者，临床复发风险明显低于HBV DNA/HBV RNA阳性者，HBV RNA/DNA双阴性可以指导CHB患者NAs的安全停药。
国外一项纳入344例CHB者的研究报道，均给予了抗HBV治疗（PegIFN单药或联合NAs）48~72周，对HBeAg阴性的患者在停药6个月后观察，HBsAg＜3 log和＞3 log病毒持续应答率（HBV DNA＜2 000 U/mL）为41.6% vs. 0.7%，HBV RNA阳性和阴性的病毒持续应答率32.7%vs.2.9%，HBcrAg＜3 log和＞3 log病毒持续应答率为33.6% vs. 7.8%；HBsAg＜3 logHBV DNA阴性的病毒学应答高达63.9%，联合HBV RNA阴性和HBsAg＜3 log能指导CHB患者的停药。
北京大学的一项研究，纳入HBeAg阳性CHB者139例，发现HBsAg≥100 U/mL+HBV RNA阳性，随访24个月的临床复发率为58.4%，而HBsAg＜100U/mL+HBV RNA阴性随访24个月的临床复发率仅5.8%，表明HBsAg＜100 U/mL+HBV RNA阴性对HBeAg阳性的CHB者停止NAs治疗后病毒学复发风险低。还有研究认为，基线血HBV RNA水平≤2×105拷贝/mL且经干扰素治疗12周时≤300拷贝/mL者，停药随访24周时HBeAg血清转换率可达92.9%。
新近一项对HBsAg＜200 IU/mL且符合国际推荐的停药标准的NAs治疗的CHB者停药，随访48周的研究发现，HBV RNA≥44.6 U/mL的患者的48周累积HBV DNA复发率为93.2%，HBV RNA低于检测下限者48周累积复发率为9.1%。38.7%的患者出现停药后ALT升高。但HBV RNA阴性的停药者病毒学复发率也高达36.6%。基于HBV RNA测定尚未标准化，以及这些检测方式在敏感性、特异性以及RNA种类（前基因组RNA与亚基因组RNA）的检测方面存在异质性，均可能影响HBV RNA的测定结果。HBV RNA和HBsAg联合预测，仅有9.1%的患者出现复发。
由上述报告可见，对评估CHB停药后的复发风险，HBV RNA可能具有独特的应用价值。但也有研究发现，不伴随HBsAg或HBcrAg下降的单独HBV RNA下降者，HBsAg清除率和持久应答率低，联合HBsAg、HBcrAg和HBV RNA指标可更好地预测基于PegIFN治疗的HBsAg清除率和停药持续应答率。
（3）预测HBV相关性肝癌及其术后的复发风险：国内外迄今已有多个研究指出，HBV RNA与HCC关系密切，且高于HBV DNA与肝癌的评估价值。
（4）指导发现新药作用靶点：众多抗HBV新药类别中，衣壳装配调节剂类（CAMs）靶向HBV核心蛋白，将有望成为最具潜力的抗病毒靶标。近年越来越多处于临床试验阶段的CAMs，将显著下降的血清HBV RNA水平作为评判抗HBV疗效的血清学指标之一。与之相关，2019年FDA发布的《慢性乙型肝炎病毒感染药物研发指导意见(草案)》中，已将血清HBV RNA 作为评价新药的疗效终点指标之一。HBV RNA的测量还有助于监测除HBV DNA抑制之外的治疗效果，可能成为新药疗效评估的标志物；HBV RNA还可帮助预测哪些患者在停药后处于HBV复发的高风险中，并且具有评估新型HBV药物疗效的潜力。
（5）区分HBV非活动携带者：HBV非活动携带者表现为HBeAg阴性、ALT水平持续正常，HBV DNA＜2 000IU/mL，以及轻度或无肝纤维化。非活动携带者意味着良好的长期预后，很低的肝硬化和HCC发生风险。研究表明，HBV非活动携带者中的HBV RNA水平显著降低，因此HBV RNA测定对此具有识别意义，有助于制定适合的治疗、随访方案。
总之，HBV RNA作为一种新型HBV血清学标志物，有关研究日益受到关注，虽检测方法不同，亦已显示出较大的临床意义。但不同HBeAg状态、不同抗HBV药物，可能会影响循环HBV RNA水平，HBV RNA虽与NAs、PegIFN等抗病毒治疗应答相关，仅有HBV RNA下降而不伴随HBsAg/HBcrAg下降的患者HBsAg清除率不佳。提示单凭HBV RNA指标预测治疗疗效的准确性仍有待商榷，HBV RNA联合其他病毒抗原预测治疗终点或许更可靠，仍需大样本的前瞻性研究支持。
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（来源：《国际肝病》编辑部）
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